Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

Резюме

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Аннотация

Репликация генома происходит во время S-фазе клеточного цикла в сильно регулируемом процессе, который обеспечивает точность дублирования ДНК. Каждый геномная область реплицируется в отдельное время во время фазы S через одновременной активации нескольких начала репликации. Время репликации (ПКВ) коррелирует со многими геномных и эпигенетических особенностей и связан с частоты мутаций и рака. Осмысливая полную геномную вид программы репликации, в здоровье и болезни является одной из основных целей будущего и вызов.

В данной статье подробно описывается "Copy Number Коэффициент S / G1 для отображения геномную времени репликации" метод (в данном документе под названием: CNR-TOR), простой подход к карте генома широкий ToR клеток млекопитающих. Метод основан на количестве копий различий между S фазы клеток и фазы G1 клеток. Метод CNR-TOR выполняется в 6 этапов: 1. Подготовка клеток и окрашивание пропидиума йодида (PI); 2. Сортин G1 и фазы S клетки с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS); 3. Очистка ДНК; 4. Ультразвуком; 5. Подготовка библиотеки и последовательности; и 6. Биоинформатический анализ. Метод CNR-TOR является быстрый и простой подход, который приводит к репликации подробных карт.

Введение

Млекопитающим репликации ДНК жестко регулируется, чтобы обеспечить точную репликацию каждой хромосомы только один раз в течение клеточного цикла. Репликация происходит в соответствии с жестко регламентированной порядке - несколько больших геномных областей (~ Мб) реплицировать в начале фазы S (начало репликации доменов) , тогда как другие геномные области репликации позже в средней или поздней фазе S (средние и поздние реплицирующихся доменов) ^1. Большая часть генома реплицируются в то же время во всех тканях (конститутивные домены ПКВ), в то время как 30% - 50% генома, меняет свое техническое задание между тканями ^2, во время дифференцировки ^{3, 4} , и в меньшей степени , также во время раковой трансформации ⁵ , Кроме того, некоторые геномные области репликации в асинхронном режиме ^{6, 7, 8,} а именно есть разницав ПКВ между двумя аллелями.

ToR коррелирует со многими геномных и эпигеномном функций , включая уровни транскрипции, содержание GC, хроматина состояние, плотность генов и т.д. ^{1, 9.} ToR также связан с частоты мутаций и типов ^{10, 11} и , следовательно , неудивительно, что возмущения программы репликации связаны с раком ^{12, 13.} Причинно-следственная связь между ПКВ и структуры хроматина пока не понял. Вполне возможно, что открытая хроматина способствует раннему репликации. Тем не менее, альтернативная модель предполагает , что хроматин собирается во время репликации и различные регуляторы хроматина , присутствующие в начале и в конце S фазы приводят к дифференциальной упаковки ранних и поздних воспроизводящихся областей ^{1, 14} . Недавно мы показали , что формирует техническое задание содержание GC, влияя на тип мутаций , которые происходят в различных геномных областей ^11.

Флуоресцентная гибридизация (FISH) в основной метод для измерения ПКВ на отдельных локусов. Она осуществляется просто путем подсчета процента клеток фазы S , которые обладают одной рыбы сигналы vs. процент дублетов для заданного аллель ^{15, 16.} Альтернативный способ, состоит из последовательностей импульсов мечения ДНК , с помощью BrdU, сортировка клеток в соответствии с их содержанием ДНК в различные моменты времени по S, иммунопреципитации ДНК , содержащей BrdU, и проверять обилие осажденной ДНК с кПЦР ^17.

Геномные отображение ТЗ может быть достигнуто двумя способами. Первый способ представляет собой геномную вариант метода, основанного BrdU-IP описанный выше, в котором количественное определение суммыосажденной ДНК в каждой фракции осуществляется одновременно в течение всего генома путем гибридизации с микрочипов или глубокой последовательности. Второй метод, CNR-ToR, основан на измерении числа копий каждой геномной области фазовых клеток S и нормализацию по содержанию ДНК в G1 клетках. В этом способе клетки сортируются по FACS в не-тиражирование (G1 фаза) и тиражирование (фаза S) группы (рисунок 1). Клетки в G1 имеют один и тот же номер копии всех геномных областей и, следовательно, их содержание ДНК должно быть одинаковым. С другой стороны, ДНК, число копий в S зависит от технического задания, так как ранние регионы Дублирование подверглись репликации в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК удваивается, в то время как поздние регионы Дублирование еще не реплицируются в большинстве клеток и, следовательно, их содержание ДНК будет быть похож на G1 клеток. Следовательно, S соотношение G1 содержания ДНК свидетельствует о ПКВ. Количество ДНК для каждой области генома измеряется либо путем гибридизациимикрочипов или глубокой последовательности ^{2, 8.} будут дополнительно обсуждены преимущества метода CNR-TOR.

В данной статье описывается метод CNR-TOR для геномного картирования ToR , как описано на рисунке 2. В статье рассматриваются мелкие детали всего процесса от момента сбора клеток до базового анализа результатов и создания геномных ToR карт. Протокол, описанный в этой статье была успешно выполнена на различных типах клеток, выращенных в культуре. Дальнейшее совершенствование этого протокола может привести к отображению ПКВ в естественных условиях и в редких типов клеток.

протокол

Примечание: TOR может быть измерена только на растущих, несинхронизированных клетках. Эта процедура должна начинаться с по крайней мере , 1 - 2 х 10 ⁶ быстро растущих клеток, которые обычно приводят к ~ 1 × 10 ⁵ клеток в фазе S (шаг ограничение скорости). Рекомендуется проводить каждый эксперимент с использованием двух или трех повторах. Весь процесс CNR-TOR может быть завершена в течение одной недели - через два дня должен быть посвящен всем шагам до подготовки библиотеки, от одного до двух дней, необходимых для секвенирования и дополнительный день необходимо для первоначального анализа данных.

1. Сбор клеток из культуры

Примечание: Протокол написан для клеток , растущих в культуре в 10 см пластинах (содержащих примерно 2 - 5 × 10 ⁶ клеток), но может быть легко отрегулирована на другие платформы.

1. Для клеток, выращенных в суспензии, перейти к фиксации (раздел 2).
2. Для прилипшие клетки, аспирация и мыть плел с 3 мл PBS без Са ²⁺ и Mg ^2+.
3. Выбросите PBS и инкубируют клетки в течение 5 мин при 37 ° С в 1 мл трипсина-коммерческого ЭДТА, пока клетки отделяться.
   Примечание: Продолжительность обработки трипсином должна быть отрегулирована для каждого типа клеток.
4. Добавьте 3 мл культуральной носитель для нейтрализации трипсина и собирают клетки в 15 мл коническую пробирку или 5 мл полистирола трубки. Держите на льду.

2. Закрепление

Примечание: В этой части все шаги должны быть сделано при 4 ° С.

1. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
2. Отберите и мыть клетки дважды 1 мл холодного PBS.
3. Ресуспендируют клеток в 250 мкл (общий) холодной PBS.
4. В то время как осторожно встряхивая пробирку, медленно по каплям добавляют 800 мкл 20 ° C 100% этанола. Это приводит к конечной концентрации этанола 70 - 80%.
   Примечание: Высокий этанол чистота рекомендуется на этом этапе.
5. Инкубируйте клетки на льду Foг 30 мин.
   Примечание: На этом этапе клетки могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или в течение нескольких месяцев при -20 ° C.

3. PI Окрашивание

1. Центрифуга клетки при 500 мкг в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
2. Аспирируйте супернатант тщательно и мыть клетки дважды 1 мл холодного PBS.
3. Отберите и ресуспендирования каждый образец со следующей смеси: 1 мл PBS, 5 мкл 10 мг / мл РНКазы А, йодид пропидия 50 мкл 1 мг / мл (PI; перемешать флакон перед использованием). Отрегулируйте концентрацию до ~ 2 · 10 ⁶ клеток / мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хранить света - PI чувствителен к свету.
4. Фильтруют через 35 мкм меш в 5 мл полистирола трубки и близко парафильмом.
5. Выдержите при комнатной температуре в темноте в течение 15 - 30 мин.
   Примечание: Клетки теперь готовы для анализа FACS. При необходимости, Окрашенные клетки могут храниться в течение не менее 24 ч при температуре 4 ° С в темноте.

4. Сортировка

1. Сортировка клеток с использованием машины FACS. НасЕ 561 нм лазер дифференцироваться клетки в зависимости от их интенсивности ПИ. Другие лазеры вблизи максимума возбуждения на 535 нм, как 488 нм или 532 могут использоваться в зависимости от конфигурации FACS машины.
2. Для получения оптимальных результатов используйте наименьшее сопло рекомендованного для конкретного размера ячейки (для большинства клеток 85 мкм). Приоритетность режимы чистоты по сравнению с выходом. Используйте постоянный медленный поток, как правило, до 300-500 событий / с, при давлении оболочки 45 фунтов на квадратный дюйм.
3. Использование стробирования, различать мертвые клетки и субклеточных мусора (FCS низкие и высокие SSC), откладывая FCS против SSC. Из жизнеспособных клеток дискриминировать дублеты путем построения графика SSC-Ширина (W) против SSC-высота (H) , а затем FSC-W против FSC-H участка и по PI- W против PI-H (дублеты будет иметь тот же H-значение но больше W-значение). Для получения жизнеспособных одиночных клеток начертить гистограмму интенсивности ПИ-зона (А), которая представляет содержание ДНК в клетках.
4. Сортировка клеток в фазах G1 и S, как показано на рисунке 1, Gating для S должны быть широкими и вторгаться в G1 и G2 фаз, в то время как G1 стробирования должна быть узкой и как можно дальше от S, насколько это возможно.

Рисунок определение фазы цикла 1. Ячейка на основе интенсивности ПИ. Гистограмма, показывающая распределение содержания клеточной ДНК (измеряется PI-площадь) мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) населения. Содержание ДНК используется для сортировки население на две подгруппы населения I) G1 клетки (содержание 2н ДНК) и II) S фазы клетки (2N - 4N содержание ДНК), используя отмеченные регионы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Примечание: Цель коллекции G1 клеток для учета погрешностей в эффективности между различными секвенирования геномных областей. Альтернативное приложениеРоач является использование G1 клеток, захваченных из того же самого типа клеток. Такой подход дает более чистые результаты (так как это сводит к минимуму загрязнение фазы S), но это может ввести предвзятости, вытекающие из генетических различий между арестованными клеток и измеренных клеток.

5. Сортировка в холодных условиях и сбора отсортированных клеток в 1,5 / 2 мл пробирки. Хранить трубы на льду следующие сорта.
   Примечание: Для того , чтобы улучшить восстановление ДНК, то лучше использовать низким связыванием трубы или использовать трубы с покрытием с 4 - 5% БСА в течение 1 - 3 ч при 4 ° С ^18.

5. ДНК Очистка

1. Для каждого образца (G1 и S) очищают ДНК с использованием набора для очистки ДНК.
   Примечание: При использовании коммерческого набора, элюции 400 мкл буфера для элюции в 2 мл пробирку для высокого выхода, в соответствии с рекомендациями производителя.
2. Проверьте концентрацию ДНК с помощью флуорометр.
   Примечание: Из 100000 клеток млекопитающих, собранных FACS, следует получить ~ 1 мкг ДНК.т этот этап ДНК может сохраняться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или при -20 ° С в течение длительного хранения.

6. Ультразвуком

1. Перенос ДНК в 1,7 мл пробирку, который совместим с магнитной подставкой, используемой.
2. Концентрат ДНК с использованием 2х SPRI бусин в соответствии с инструкциями производителя, используя магнитную стойку, и элюирования в 50 мкл буфера для элюции.
3. Shear ДНК с сфокусированного ультразвукового дезинтегратора до среднего размера целевого пика 250 пар оснований. Используйте следующие параметры для образца ДНК в 50 мкл: 50 Вт, 20% коэффициент заполнения, 200 циклов в порыве, 20 ° C, 120 сек.
4. Проверьте размер фрагментированной ДНК с помощью электрофореза. Рекомендуемый размер дистрибутива составляет 200 - 700 пар оснований с максимумом при ~ 250 пар оснований.
   Примечание: На этом этапе ДНК может сохраняться в течение нескольких дней при температуре 4 ° С или при -20 ° С в течение длительного хранения.

7. Библиотека Подготовка и секвенирование

Примечание: Многие наборы для подготовки библиотеки и различающиесялор секвенирование платформы должны работать так же, как те, которые используются нами и упомянутые в разделе материалов. На самом деле в прошлом, ToR карты были получены с использованием очень похожий метод с микрочипов платформ ^2.

1. Подготовка библиотеки с использованием любого набора коммерческой подготовки библиотеки.
2. По окончании подготовки библиотеки, выберите размер с помощью магнитных шариков 300 - 800 пар оснований.
3. После подготовки библиотек, измерения концентрации ДНК с помощью флуорометр.
4. Измерьте размер ДНК с помощью электрофореза.
5. Выполните последовательность на любой платформе.
   Примечание: Секвенирование по меньшей мере, 10 М читает на пробу рекомендуется. Эта глубина эквивалентно прочитанного приблизительно каждые 300 пар оснований (за ~ 3 Гб размер геномов), и является достаточным для измерения ToR при разрешении 50 - 100 кб. Увеличение глубины приведет к уменьшению размера окна и, таким образом, позволит увеличить разрешение с более высокой достоверностью. Соединенный конец последовательности не является необходимым вэтот протокол, поскольку информация только покрытия собирается. Это, однако, может помочь в решении местоположения прочтений, которые содержат повторяющиеся последовательности.

8. Анализ

Примечание: анализ данных на основе метода , используемого А. Корен и соавт. ^19.

1. Карта секвенирования данные соответствующему генома с использованием bowtie2 или из любого надежного чтения короткий выравнивателя. Определить изменения размера, равного охвата хромосомные окна в виде сегментов, охватываемых 200 считывает в G1 фракции и рассчитывать фазы S читает в тех же окнах.
2. Рассчитать отношение S / G1 для каждого окна. Это должно создать карту с большими колебаниями в соотношении S / G1 вдоль генома (рисунок 3). Хороший контроль за достоверность измерений ToR, чтобы сравнить эту карту с соотношением G1 / G1 (от двух отдельных измерений G1), которая должна быть гораздо более пологой.
3. Нормализация Данные 0 означают и 1 SD путем вычитания из каждого VALUE среднее значение всех окон (за исключением Х-хромосомы) и разделив результат на стандартное отклонение S / G1 всех окон. Это делается для того, чтобы преобразовать в г баллов и возможность сравнения между различными экспериментами.
4. Удалите все щелевые участки, перечисленные в геноме браузера УСК, а также каждого оставшегося фрагмента между зазором, содержащего менее 15 окон данных.
5. Гладкая оставшиеся фрагменты с кубической сглаживающего сплайна через функцию csaps Matlab с параметром 10 ^{- 16} и интерполировать в заданных точках через каждые 100 кб.
   Примечание: Параметры сглаживания и интерполяции должны быть скорректированы на основе глубины данных. Другие подходящие способы и функции сглаживающих существуют и могут быть использованы.
6. После того, как визуально подтверждения достоверности каждой репликации, объединить все операции чтения и вычислить более глубокий профиль разрешения, выполняя тот же процесс, описанный выше, по этим данным.

Результаты

Типичная карта ToR показана на рисунке 3 для эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ). На этом рисунке показано, процесс анализа, так как он показывает как точки, которые являются нормализованное отношение / G1, S для отдельных окон (этап 8.3), а также линии, возникающее...

Обсуждение

CNR-TOR может быть выполнена в принципе на любой эукариотической популяции пролиферирующих клеток , которые могут быть разделены на FACS к S и G1 фазы (обзор Ринда Н. и Гилберта DM ^20). Метод, описанный здесь, был скорректирован к клеткам млекопитающих с размером генома ~ 3 Gb, таких как ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	BI (Biological Industries)	02-023-1A
Trypsin-EDTA	BI (Biological Industries)	03-052-1B
15 mL conical tube	Corning	430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap	BD-Falcon	352235
Ethanol	Gadot	64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL	Sigma	R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL	Sigma	P4170
Parafilm	Parafilm	PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes	Eppendorf	22431021
BSA	Sigma	A7906
1.7 mL MaxyClear tube	Axygen	MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Ultrasonicator	Covaris	M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm	Covaris	520096
Qubit fluorometer	Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit	Invitrogen	Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system	Agilent	D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system	Illumina	SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification	Qiagen	69504
PureProteom Magnetic Stand	Millipore	LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC	DAKO	F7210
FACS sorter	BD	FACSARIA III
FACS software	BD	FACSDiva v 8.0.1