В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Резюме

Мы представляем здесь протокол для дифференциации человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в каждом Сомит производная (Миотом, Склеротом, дерматом и syndetome) в химически определенных условий, который имеет применения в будущих болезней моделирования и на основе клеток терапии в ортопедической хирургии.

Аннотация

В ответ на сигналы, такие как WNTs костных морфогенетических белков (БМП) и Еж Соник (ТСС) выделяется из окружающих тканей, сегменты (SMs) порождают несколько типов клеток, в том числе Миотом (Миопатии), Склеротом (SCL), дерматом (D) и syndetome (SYN) , который, в свою очередь, развиться в скелетных мышц, Осевой скелет, спинной дермы и осевой сухожилия/связки, соответственно. Таким образом поколение SMs и их производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) имеет решающее значение для получения плюрипотентных стволовых клеток (Чок) для применения в регенеративной медицине и для исследований болезней в области ортопедической хирургии. Хотя протоколов индукции Миопатии и нежелательной почты от Чок ранее сообщали несколько исследователей, не исследование еще не продемонстрировал индукции SYN и D от iPSCs. Таким образом эффективное всасывание полностью компетентным SMs остается серьезной проблемой. Здесь мы пилки человека патронирования SM с человеческой iPSCs в пробирке путем передразнивать сигнальную среду во время разработки SM куриных/мыши и доклад о методах систематического индукции SM производных (Миопатии, SCL, D и SYN) от человека iPSCs под химически определенных условиях через presomitic мезодермы (PSM) и SM государств. Знания о куриных/мыши SM развития был успешно применен к индукции SMs с человеческой iPSCs. Этот метод может быть Роман инструментом для изучения человеческого somitogenesis и кучность без использования эмбрионов и для терапии на основе ячеек и моделирование болезней.

Введение

Разработка метода направленного дифференцирования для нужной ячейки типа от Чок является необходимым шагом для перевода исследование PSC-производные клеток на клинических приложений. Принудительного выражение ключевых генов является перспективной стратегией для органа клеточная дифференцировка от ЦОНов и улучшилось понимание генетического регулирования определение судьбы клетки, органа морфогенеза и Организации во время эмбриогенеза¹. Кроме того изложив эндогенного сигнальных средах, используя развитие зародышей мыши и куриных как дорожную карту, считается необходимым для направленного дифференцирования Чок. Однако учитывая применение СМБ производные клеток в клинических исследованиях, например на основе ячеек терапии, последняя стратегия больше подходит потому, что она не требует генные манипуляции.

Несколько исследований сообщили индукции мезодермы от человека и мыши ЦОНов в химически определенных условий. Как правило эти методы полагаются на activin/узловой/преобразование сигнализации фактор роста β (TGFβ) и костный морфогенетический белок (BMP) сигнализации, предполагается выполнить мезо энтодермы и мезодермы дифференциации, что приводит к низкой индукции эффективности параксиальная мезодерма (около 20%)². Иными словами PSC-производные мезодермы, вызванных этими сигнальные пути был главным образом боковой пластине мезодермы, а не параксиальная мезодерма. Недавно несколько исследований продемонстрировали эффективное производство PSC-производные параксиальная мезодерма, основанных на различных стратегий^3,4,5,6,7,8 . В этих исследованиях были культивированный ЦОНов с относительно высокой концентрации гликогена синтазы киназа 3 (GSK3) ингибиторы (WNT сигнализации активаторы), поэтому эффективность индукции параксиальная мезодерма достиг 70%-95%^6,7 .

В somitogenesis параксиальная мезодерма сначала образует presomitic мезодермы (PSM) кзади, а затем сегменты (SMs) в передней части через мезенхимы эпителиальных перехода^9,10. Вырезка лигандом Дельта как 1 (DLL1) как известно ключевую роль во время somitogenesis, как колебательная управления DLL1 выражения, оба уровня мРНК и белка, регулирует SM сегментации. СМС в конечном итоге вентрально подразделяют на две части, что привело к dermomyotome (DM) дорсально и Склеротом (SCL)¹¹. Впоследствии DM отличает в дерматом (D), предшественник дермы, и Миотом (Миопатии), предшественник скелетных мышц; Кроме того брюшной части SCL образует syndetome (SYN), предшественник сухожилий и связок в¹² (рис. 1). Некоторые исследователи сообщили индукции PSC-производные SM производных такие Миопатии^4,13 и¹⁴нежелательной почты; Однако существует несколько ограничений в этих исследованиях. Примечательно так как наши знания о сигнальных средах D и SYN фрагментарны, протоколов индукции D и SYN не еще были созданы систематически. Чтобы продемонстрировать полный компетенция SMs индуцированной из УИК, важно показать мульти дифференциация емкость индуцированных SMs во всех четырех производные (D, Миопатии, SCL и SYN), в то время как предыдущие исследования были сосредоточены только на конкретные производные SM. Здесь мы сообщаем о том, как генерировать все четыре SM производные, включая D и SYN, через PSM и SM судьбы человека iPSCs¹⁵. Мы считаем, что создание в пробирке поэтапный метод этой модели SM процесс развития может способствовать изучение как человеческие SM развивается во время эмбриогенеза, без использования эмбрионов.

протокол

Все экспериментальные протоколы с участием человека iPSCs были утверждены Комитетом по этике Департамента медицины и высшая школа медицины, Университет Киото.

1. человека iPSCs подготовка перед индукции

Примечание: Культура человека iPSCs (201B7-PAX3-GFP) на SNL фидер клетки¹⁶ с Предстоятелем ES клеток средних дополнена 4 нг/мл рекомбинантного человеческого основные фибробластический фактор роста (FGF2) и 0,5% пенициллина и стрептомицина (именуемым далее как Госкомсанэпиднадзором среды, см. Таблица 1). Когда коэффициент слияния достигает 70%-80%, проход клетки как описано¹⁷.

1. Пассированый из человека iPSCs на SNL фидер клетки¹⁷
   1. Для пассированый, добавить PBS в блюдо культивирования клеток и промойте клетки. Затем удалите PBS (далее, этот процесс будет называться мыть с PBS).
   2. Добавить 1 мл раствора CTK (см. таблицу 1) при комнатной температуре (RT) и подождите, пока клетки фидера SNL начать отсоединение от нижней части блюдо.
   3. Удаление решения CTK и затем смывают дважды с PBS.
   4. Добавьте 1 mL Госкомсанэпиднадзором среды (см. таблицу 1) в блюдо, затем очистите клетки с помощью скребка и собирать в коническую пробирку 15 мл.
   5. Аккуратно Пипетка содержимого пять раз с помощью кончика 1000 мкл и затем передать новое блюдо, заполнены с Госкомсанэпиднадзором среднего. Использование Сплит соотношение 1:4 до 1:10, в зависимости от соотношения слияния перед пассированый. Кроме того изменять объем Госкомсанэпиднадзором среды в зависимости от масштаба блюдо (например, 3 мл на 6 см блюдо, 8 мл на 10 см блюдо).
   6. Инкубируйте человека iPSCs при 37 ° C и 5% CO₂.
   7. Изменение средних ежедневно (за исключением на следующий день после пассированый) и культура клетки до следующей процедуре passaging.
2. Фидер бесплатно культивирование человека iPSCs до PSM индукции
   Примечание: свести к минимуму влияние факторов роста, выделяется из клеток фидер SNL, культура человека iPSCs условиях свободной подачи с питательной среды фидер свободных клеток (см. таблицу 1) на решения внеклеточного матрикса (ECM) (см. таблицу 1) покрытые блюдо за 3 дня до PSM индукции.
   1. День -4 (4 дня до начала индукции PSM)
      1. Чтобы приготовить блюдо с покрытием решения ECM, добавьте 4 мл раствора ECM на 10 см блюдо на 4 ° C на ночь.
         Примечание: Место решение ECM на льду во время подготовки.
   2. День -3
      1. Во-первых удалите решение ECM от блюдо и добавьте 8 мл фидер свободных клеток питательной среды.
      2. Чтобы начать фидер бесплатно культивирования, мыть раз с PBS для полоскания культивируемых клеток.
      3. Добавьте 1 мл раствора CTK на RT, пока клетки фидера SNL начать отсоединение от нижней части блюдо.
         Примечание: Использование микроскопии для подтверждения всех клетки фидера отсоединяются от дна.
      4. Удаление решения CTK и мыть с PBS дважды, таким образом, чтобы полностью удаляются все клетки фидера SNL.
      5. Добавьте 1 mL фидер свободных клеток питательной среды в блюдо, а затем скрести клетки с помощью скребка и собирать их в коническую пробирку 15 мл.
      6. Осторожно Пипетка содержимое, три раза с помощью кончика 1000 мкл, а затем передать новое блюдо 10 см, покрытые решения ECM (подготовлен во время шага 1.2.1). Использование Сплит соотношении примерно 1:2 до 1:4, в зависимости от слияния соотношение до свободной подачи культивирования.
      7. Инкубируйте человека iPSCs при 37 ° C и 5% CO₂ на 3 дня, изменив носитель на день -1.

2. PSM дифференциации и изоляции путем активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS)

1. PSM дифференциации (день 0 – день 4)
   1. Аспирационная фидер свободных клеток питательной среды и добавить 8 мл PSM индукции среды (базальный среднего МЧР с 10 мкм SB431542, 10 мкм CHIR99021, 2 мкм DMH1 и 20 нг/мл FGF2, см. таблицу 1).
      Примечание: Слияние клеток в начале PSM дифференциация имеет решающее значение для эффективности индукции. Использование микроскопии для подтверждения вырожденная соотношение составляет примерно 30%.
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO₂, 4 дней, изменения среды на 3 день.
   3. Урожай клетки для СУИМ в день 4 (раздел 2.2, ниже).
2. Изоляция DLL1 позитивные PSM клеток путем активации флуоресценции клеток, сортируя (FACS)
   Примечание: ниже приводится процедура подготовки клетки до СУИМ сортировки DLL1 позитивных клеток. Выполняют СУИМ сортировки с помощью проточный цитометр, по словам производителя протокол.
   1. Аспирационная носитель, а затем вымыть с PBS. Впоследствии добавьте 1 mL реагента диссоциации клеток и оставить на 3 мин на RT.
   2. Добавить 4 мл МЧР базальной среды, очистите клетки с помощью скребка и собирать их в коническую пробирку 15 мл.
   3. Подсчитать количество ячеек с помощью счетчика автоматизированные ячейки, а затем центрифуги на 280 x g на 3 мин.
   4. Тщательно удалить супернатант стремлением и Ресуспензируйте ячейки в буфер СУИМ (см. таблицу 1) в концентрации 1,0 x 10-⁷ кл/мл. Для образца отрицательный контроль (изотипа управления, или в Конвенции без антитела), передача 50 мкл в 15 мл Конические трубки, а затем приостановить с 450 мкл буфера СУИМ.
   5. Добавить DLL1 антитела (см. Таблицу материалы) в соотношении 1/200. Защитить трубы от света и держать на льду за 30 мин.
   6. Центрифуга на 280 x g на 3 мин.
   7. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте СУИМ буфера (1,0 x 10-⁷ кл/мл) с 1 мг/мл DAPI.
   8. Передача в коллекции трубку, объединена с 35 мкм нейлоновая сетка в крышке для фильтрации, затем поместите трубку на льду до завершения сортировки. Выполните ту же процедуру с отрицательного контроля образца (шаг 2.2.4).
   9. Выполните сортировку с помощью проточный цитометр согласно протоколу производителя.
   10. Соберите отсортированный DLL1 позитивных клеток в 15 мл Конические трубки, содержащий 4 мл МЧР базальной среды с 10 мкм Y27632. Для всего РНК добыча центрифуги на 280 x g 3 мин затем Ресуспензируйте РНК литического буфера и хранить при температуре от-30 ° C. Смотрите извлечение RNA, обратной транскрипции и RT-ПЦР процедур (статья 5.1) для более подробной информации.
   11. Выполнять SM дифференциации, с использованием сортировки клеток согласно ниже протокол (раздел 3).

3. SM дифференциации от PSM

1. SM дифференциации от отсортированных DLL1 PSM клеток (4-день 8-й день)
   Примечание: подготовить пластины с покрытием решения 12-ну ECM за день до сортировки СУИМ. Подготовить ECM с покрытием решения 12-ну плиты, добавить 1 мл раствора ECM в каждой скважине на 4 ° C и оставить на ночь. Держите решение ECM на льду во время подготовки.
   1. Следующий шаг 2.2.10, центрифуги на 280 x g на 3 мин.
   2. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл среды индукции SM (базальный среднего МЧР с 10 мкм SB431542 и 5 мкм CHIR99021, см. таблицу 1).
   3. Подсчитать количество ячеек с использованием автоматизированных ячейки счетчика.
   4. Семя 1.0 x 10⁵ клеток на каждой скважине ECM плит по 12-ну решение покрытием, содержащие 1 мл SM индукции среды с 10 мкм Y27632.
   5. Инкубируйте при 37 ° C с 5% CO₂ за 4 дня до 8 день. Изменения среды, не содержащие Y27632 на 5 день (день после сортировки FACS) и 7 дней.
   6. Выполняйте SM производные дифференциации с использованием искусственных клеток SM согласно протоколам ниже. Для всего извлечение RNA от индуцированного SM клеток собирать клетки в 15 мл конические и центрифуги на 280 x g на 3 мин, затем Ресуспензируйте РНК литического буфера и хранить при температуре от-30 ° C.

4. SM производные (DM, Миопатии, D, SCL, SYN) дифференциации от SM

Примечание: Чтобы продемонстрировать полный компетенция SM ячеек, сначала выполните DM (dermomyotome) и индукции SCL (Склеротом), соответственно с использованием iPSC производные SM клеток. Впоследствии выполняют Миопатии (Миотом) и D (дерматом) индукции, используя DM клетки и проводить индукции SYN (syndetome), с использованием клеток SCL. Ниже приведены протоколы для индукции каждого производного (DM, Миопатии, D, SCL и SYN) от индуцированного SM клеток в пробирке.

1. Дифференциация DM от SM клеток (8-день 11 день)
   1. Аспирационная носитель, а затем добавить 1 мл ДМ индукции среды (базальный среднего МЧР дополнена 5 мкм CHIR99021 и 10 нг/мл BMP4, см. таблицу 1).
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO₂, за 3 дня до 11 день. Измените среду на 10 день (день 2 DM индукции).
   3. Выполните Миопатии и D дифференциация с помощью искусственного DM клетки согласно протоколам ниже.
2. MYO дифференциации от DM клеток (день 11 – день 41)
   1. Аспирационная носитель, а затем добавить 1 мл среды индукции Миопатии (базальный среднего МЧР дополнена 5 мкм CHIR99021, см. таблицу 1).
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO₂, за 30 дней до 41 день. Измените носитель каждые 3 дня.
3. D дифференциация от DM клеток (11 – день 20-й день)
   1. Аспирационная носитель, а затем добавить 1 мл среды индукции D (базальный среднего МЧР дополнена 5 мкм CHIR99021 и 10 нг/мл BMP4, см. таблицу 1).
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO₂, за 9 дней до 20 дней. Измените носитель каждые 3 дня.
4. SCL дифференциации от SM клеток (8-день 11 день)
   1. Аспирационная носитель, а затем добавьте 1 mL Вероятности индукции среды (МЧР базальной среднего дополняется 100 Нм SAG и 0,6 мкм LDN193189, см. таблицу 1)¹⁴.
   2. Инкубируйте клетки при 37 ° C, с 5% CO₂, на 3 дня. Измените среду на 10 день (день 2 Вероятности индукции).
   3. Выполняйте SYN дифференциации, с использованием искусственных клеток SCL согласно протоколу ниже.
5. SYN дифференциации от SCL клеток (32 11 – день в день)
   Примечание: подготовить за день до начала индукции SYN пластины с покрытием решения 24-ну ECM. Подготовить ECM с покрытием решение 24-ну плиты, добавить 0,5 мл раствора ECM в каждой скважине на 4 ° C и оставить на ночь. Держите решение ECM на льду во время подготовки.
   1. Аспирационная среды затем вымыть с PBS, затем добавить 0,2 мл реагента диссоциации клеток в каждой скважине и оставить на 3 мин на RT.
   2. Добавьте 0,8 мл МЧР базальной среднего для каждой скважины, то скрип и собрать все клетки в коническую пробирку 15 мл.
   3. Центрифуга на 280 x g на 3 мин.
   4. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте в 1 мл SYN индукции средне-1 (базальный среднего МЧР дополнены 20 нг/мл FGF8, см. таблицу 1), затем подсчитать количество ячеек с использованием автоматизированных ячейки счетчика.
   5. Семя 5.0 x 10⁴ клеток в каждой скважине ECM с покрытием решение 24-ну пластин содержащие 1 мл SYN индукции средне-1.
   6. Инкубируйте при 37 ° C, с 5% CO₂, на 3 дня.
   7. На 14 день (день 3 SYN индукции), заменить средний SYN индукции средне-2 (базальный среднего МЧР дополнена 10 нг/мл BMP7 и 10 нг/мл TGFβ3, см. таблицу 1).
   8. Инкубируйте при 37 ° C, с 5% CO₂, 18 дней до 32 дней. Измените носитель каждые 3 дня.

5. характеристика iPSC производные продукты

Примечание: После дифференциации характеризуют человека iPSCs производных с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР), immunocytochemistry (ICC), энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) и механического растяжения стимуляции анализов, соответственно.

1. Ячейка урожай, общее извлечение RNA, обратной транскрипции и количественный анализ ПЦР (RT-ПЦР) в реальном времени
   1. Собирать образцы клетки (процедуры 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) в 1,5 мл трубку, а затем центрифуги на 280 x g на 3 мин.
   2. Удалить супернатант затем Ресуспензируйте в 350 мкл буфера lysis РНК, предоставляемый соответствующей общей РНК добыча комплект.
   3. Экстракт всего РНК с помощью комплекта согласно протоколу производителя.
   4. Реверс транскрибировать изолированных 1 мкг всего РНК в cDNA, по словам производителя протокол.
   5. Выполните с помощью подходящих ферментов, реагентов и грунты по данным производителя протокол RT-ПЦР. Последовательностей праймера, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 2.
2. Immunocytochemistry (ICC)
   1. Перед выполнением immunocytochemistry с антителами, исправить клетки с 2% параформальдегида на 4 ° C на 10 мин и мыть дважды с PBS.
   2. Для permeabilization инкубации с 0,2% метанола или 0,2% Полисорбат 20/PBS (именуемой в дальнейшем PBS-T) на 4 ° C на 15 мин.
   3. Удалите permeabilization реагенты и лечить клетки с соответствующей блокировки буфера или 1% бычьего сывороточного альбумина/PBS на 4 ° C для 60 мин.
   4. Добавьте первым антителом, разбавленным с 10% блокирующий буфер в PBS-T и место на покачивая машину на 4 ° C на ночь.
   5. Вымойте три раза с PBS-T (добавить PBS-T и место на покачивая машину на RT для 10 мин).
   6. Добавьте второй антитела, разбавленным с 10% блокирующий буфер в PBS-T и место на покачивая машину на RT 60 мин. Первый и второй антитела для МУС, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 3.
      Примечание: От этого шага защите плиты/блюдо от света, завернув его в фольгу.
   7. Мыть дважды с PBS-T.
   8. Для счетчика пятнать, добавьте 1/5000 DAPI разбавляют PBS и место на покачивая машину на RT на 5 мин.
   9. Удаление решения DAPI и добавить PBS в каждой скважине.
   10. Наблюдать, окрашивание клеток под микроскопом флуоресценции. Кроме того Храните пластины/блюдо на 4 ° C до 1 месяца.
3. Энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для функционального анализа iPSC производные D
   Примечание: клетки человека фибробластов дермы (ХДФ) являются коммерчески доступными. Культура ХДФ в DMEM дополнена плода бычьим сывороточным 10% (см. таблицу 1).
   1. Семя 1.0 x 10⁵ клеток iPSC производные D и HDF на 24-ну пластин, содержащие 1 мл каждого питательной среды (D: D индукции средний, ХДФ: DMEM дополнена плода бычьим сывороточным 10%).
   2. После 3 дней культивирования клеток, собирать 100 мкл каждого носителя, место в 1,5 мл трубку и хранить при 4 ° C.
   3. Выполните серию процедур, таких как добавление обнаружения антител и вторичные антитела, согласно инструкции производителя и подсчитать количество целей путем создания стандартной кривой против концентрации элемента управления исследуемое вещество образцов.
4. Assay механического растяжения стимуляции для функционального анализа iPSC производные SYN
   Примечание: взрослого человека tenocytes являются коммерчески доступных (см. Таблицу материалы). Культура человека iPSC производные SYN и взрослого человека tenocytes на ячейку растяжения устройство для assay механического растяжения стимуляции, как описано ниже^18,19. Использование SYN индукции средне-2 и tenocytes среднего роста (см. Таблицу материалы) как средство культивирования для каждого производного iPSC SYN и взрослого человека tenocytes, соответственно.
   1. В 24 ч до растяжения, плита 1.0 x 10⁵ клетки iPSC производные SYN и человека tenocytes на ECM с покрытием решения multi хорошо тип силиконовой резины камеры, каждый с поверхностью культуры 1,5 х 1,5 см (см. Таблицу материалы).
   2. Установка камеры на устройстве для клеток растяжения и силу одноосных циклических штамм (0,5 Гц, 5%) 12 ч.
   3. Для всего РНК добыча 350 мкл буфера lysis РНК, а затем очистите и собирать клетки в 1,5 мл трубку для всего РНК добыча и последующего RT-ПЦР анализа (см. процедуру 5.1).

Результаты

С iPSCs 201B7-PAX3-GFP, в котором EGFP заменяет один аллель PAX3 кодирующая последовательность в экзона 1 были получены все данные в настоящем докладе. Создание 201B7-PAX3-GFP iPSCs будет описано в других разделах (H. Sakurai, личное сообщение). Статистическая значимость была оценена с помощью статистического программного обеспечения. P-значения ниже, чем 0,05 были значительными.

Характеристика iPSC производные PSM и SM клеток человека
Для оценки дифференциации человека iPSCs к SM через состояние PSM (рисунок 2A), анализ СУИМ, МТП и RT-ПЦР анализ были исполнены. Как показано на рисунке 2B, свыше 85% клеток были положительными для DLL1, маркер ПМБ, но негативные для PAX3, маркер см, после 4 дней PSM индукции с человеческой iPSCs. Впоследствии эта группа населения стал PAX3 SM клеток после 4 дней SM индукции. PSM-SM переход был также подтвержден ICC (рис. 2 c) и RT-ПЦР (Рисунок 2D). TBX6, MSGN1 и WNT3A, PSM маркеров были выражена в состояние PSM (4 день), но не выражены в состояние SM (8 день). PARAXIS, MEOX1 и PAX3, SM маркеры, выражена в SM, но не выражены в ПМБ. Кроме того, только окрашивание CDH11, маркером грануломах SM, накопленных на стыке ячейке, после добавления SB431542 с CHIR99021 (рис. 2е).

Характеристика SM производных, индуцированной из клеток человека iPSC производные SM
Для оценки дифференциации потенции человека iPSC производные SM, дифференциация к DM, Миопатии, D, SCL и SYN (рис. 3A) был оценен анализ в ICC и PAX3 (ГПУП)-флуоресценции. Как показано на рисунке 3B, дифференциация DM было подтверждено ALX4 и EN1 окрашивание и PAX3 (ГПУП)-флуоресценции; MYO дифференциация была подтверждена мёд, MYOG и миозина тяжелой цепи (MHC) пятная; D дифференциация была подтверждена EN1 и PDGFRa пятнать; SCL дифференциация была подтверждена PAX1, PAX9 и NKX3.2 окрашивание; и дифференциация SYN был подтвержден SCX, MKX, COL1A1 и COL1A2 окрашивание.

Характеристика D и SYN
1. энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) для функционального анализа iPSC производные D
В человеческом теле одной из основных функций фибробластов дермы является выделяют белков внеклеточного матрикса (ECM), таких как коллаген и гиалуроновая кислота, которые увлажняют кожу и помочь сохранить структуру кожи. Чтобы продемонстрировать, что сопоставимые количество белков коллагена типа 1 и гиалуроновой кислоты были выделяется в среде культуры iPSC производные D и ХДФ, Элиза была выполнена, как показано на рисунке 4A.

2. механические растянуть assay стимуляции для функционального анализа iPSC производные SYN
Как уже сообщалось в ряде исследований, механической стимуляции влияет на развитие сухожилие до и после рождения и способствует дифференциации tenocytes из прекурсоров клетки^18,19. Таким образом это хорошо известно, что реактивность к механическим воздействиям является одной из характеристик tenocytes. Чтобы продемонстрировать сопоставимые реактивности человека iPSC производные SYN и человека взрослых tenocytes, механического растяжения стимуляции пробирного была выполнена как показано на рисунке 4В.

Рисунок 1: Схема иерархической дифференциации параксиальная мезодерма. Presomitic Мезодерма это популяции клеток, что временно выходит в начале эмбриогенеза и подвергается сегментации в форме сегменты. Сегменты являются переходные стволовых клеток населения, что приводит к несколько типов клеток, таких как Склеротом, dermomyotome, syndetome, дерматом и Миотом клетки, которые в конечном итоге дифференцироваться в сухожилие/связки, кости/хряща, скелетных мышц и дермы клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: анализ СУИМ, RT-ПЦР и ICC человека iPSC производные PSM и сантиметр (A) схема протокола для SM дифференциации через PSM. (B) представитель точка участок DLL1 окрашивание и PAX3 (ГПУП)-день 4 PSM индукции и день 4 (8 день от iPSC) SM индукции флуоресценции. (C) представитель иммуноцитохимическое изображения и PAX3 (ГПУП)-день 4 PSM индукции и день 4 (8 день от iPSC) SM индукции флуоресценции. Клетки окрашивали с анти TBX6, PARAXIS и MEOX1 антител (красный) и совместно окрашивали DAPI (синий) или обнаружены с PAX3 (ГПУП)-флуоресценции (зеленый). (D) анализ RT-ПЦР маркеров для PSM и SM в iPSC, PSM и SM. Показаны средства ± стандартная ошибка (ФБ) из трех наборов экспериментов. (E) представитель иммуноцитохимическое изображений на день 4 (8 день от iPSC) см, культивируемых в S10I10 (сочетание SB431542 и IWR1, ингибитор WNT сигнализации), S10 (SB431542) и S10C5 условия (сочетание SB431542 и CHIR99021). Клетки были окрашенных с анти CDH11 антитела (красный) и совместно окрашивали DAPI (синий). iPS, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток; PSM, presomitic мезодермы; SM, Сомит; S10, SB431542 10 МКМ; C5, CHIR99021 5 МКМ; I10, IWR1 10 МКМ; Масштаб баров = 50 мкм. Эта цифра была изменена Накадзима et al. (2018)¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: ICC анализ DM, Миопатии, D, SCL и SYN продифференцировано от человека сантиметр iPSC производные (A) схема протоколов для SM производные дифференциации. (B) представитель иммуноцитохимическое изображения и PAX3 (ГПУП)-флуоресценции на день 3 (11 день от iPSC) DM индукции, день 30 (день 41 от iPSC) MYO индукции, день 9 (20-й день от iPSC) D индукции, день 3 (11 день от iPSC) Вероятности индукции и день 21 (день 32 от iPSC) SYN индукции. ДМ, клетки были окрашенных с анти ALX4 и EN1 антител (красный) и совместно окрашивали DAPI (синий) или обнаружены с PAX3 (ГПУП)-флуоресценции (зеленый); Миопатии, клетки окрашивали анти мёд, MYOG (красный) и антитела MHC (голубой), также совместно витражи с DAPI (синий); D, клетки были окрашенных с анти EN1 (красный) и PDGFRa (голубой) антител и совместно окрашивали DAPI (синий); SCL, клетки были окрашенных с анти PAX1, PAX9 и NKX3.2 (красный) антител и совместно окрашивали DAPI (синий); SYN, клетки были окрашенных с анти SCX, MKX, COL1A1 и COL1A2 (красный) антител и совместно окрашивали DAPI (синий). DM, dermomyotome; Миопатии, Миотом; D, дерматом; SCL, Склеротом; SYN, syndetome; Масштаб баров = 50 мкм. Эта цифра была изменена Накадзима et al. (2018)¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: функциональная проба индуцированных D и SYN. (A) количество коллагена типа 1 и гиалуроновой кислоты, что белки в среде культуры были проанализированы ELISA. (B) эффект механическое растяжение стимуляции на индуцированный SYN и человека взрослых tenocytes оценивали по RT-ПЦР. Показаны средства ± стандартная ошибка (ФБ) из трех наборов экспериментов. * p < 0,05; ** p < 0.01; p < 0,001 Дуннетт несколько сравнений t-тест по сравнению с растянуть (-); н.с, не значительные, ХДФ, человека взрослых дермального фибробластов. Эта цифра была изменена Накадзима et al. (2018)¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Решение средних	Reagant	Концентрация
МЧР базальной средний	Iscove на изменение Дульбекко среднего/ветчина F12	1:1
	Пенициллин/стрептомицина	0,5%
	Химически определены концентрат липидов	1%
	АПО трансферрина	15 мг/мл
	Monothioglycerol	450 мм
	Альбумина bovine сыворотки	5 мг/мл
	Инсулин	7 мг/мл
CTK решение	Воды	-
	Трипсин	0,25%
	Коллагеназы IV	0,1 мг/мл
	Хлорид кальция	1 мм
	Нокаут SR	20%
D средний индукции	МЧР базальной средний	-
	CHIR99021	5 МКМ
	BMP4	10 нг/мл
DM индукции среднего	МЧР базальной средний	-
	CHIR99021	5 МКМ
	BMP4	10 нг/мл
Решение ECM	Искусственные внеклеточная матрица	0.3 мг/мл
	DMEM/F12	-
СУИМ буфер	PBS	-
	Альбумина bovine сыворотки	0,1%
Фидер свободных клеток культуры среднего	mTeSR1	-
	Пенициллин/стрептомицина	0,5%
Волокнистые культуры среднего	DMEM	-
	Плода бычьим сывороточным	10%
Госкомсанэпиднадзором среднего	Предводитель ES клеток среднего	-
	Пенициллин/стрептомицина	0,5%
	FGF2	4 нг/мл
MYO индукции среднего	МЧР базальной средний	-
	CHIR99021	5 МКМ
PSM индукции среднего	МЧР базальной средний	-
	SB431542	10 МКМ
	CHIR99021	10 МКМ
	DMH1	2 МКМ
	FGF2	20 нг/мл
SCL индукции среднего	МЧР базальной средний	-
	SAG	100 Нм
	LDN193189	0,6 МКМ
SM индукции среднего	МЧР базальной средний	-
	SB431542	10 МКМ
	CHIR99021	5 МКМ
SYN индукции средне-1	МЧР базальной средний	-
	FGF8	20 нг/мл
SYN индукции средне-2	МЧР базальной средний	-
	BMP7	10 нг/мл
	TGFΒ3	10 нг/мл

Таблица 1: Средства массовой информации и решения рецепты.

ИМЯ	Вперед	Реверс
ACTB	CACCATTGGCAATGAGCGGTTC	AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
COL1A1	GGACACAGAGGTTTCAGTGGT	GCACCATCATTTCCACGAGC
MEOX1	GAGATTGCGGTAAACCTGGA	GAACTTGGAGAGGCTGTGGA
MSGN1	GGAGAAGCTCAGGATGAGGA	GTCTGTGAGTTCCCCGATGT
PARAXIS	TCCTGGAGAGCTGTGAGGAT	CACACCCTGTCACCAACAGT
PAX3	AGGAAGGAGGCAGAGGAAAG	CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG
SCX	CCCAAACAGATCTGCACCTTC	GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC
TBX6	AGCCTGTGTCTTTCCATCGT	AGGCTGTCACGGAGATGAAT
TNMD	CCCTTCATGCTGAAGCCACTT	CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG
WNT3A	CAAGATTGGCATCCAGGAGT	ATGAGCGTGTCACTGCAAAG

Таблица 2: Грунтовка последовательности для RT-ПЦР анализа.

		Концентрация
1-й Антитела	ALX4_Goat	1/50
	CDH11_Mouse	1/1000
	COL1A1_Rabbit	1/100
	COL2A1_Mouse	1-2 мкг/мл
	EN1_Rabbit	1/50
	MEOX1_Rabbit	1/50
	MHC_Rabbit	1/200
	MKX_Rabbit	1/50
	MYOD_Rabbit	1/500
	MYOG_Mouse	1/400
	NKX3.2_Rabbit	1/50
	PARAXIS_Rabbit	1/50
	PAX1_Rabbit	1/50
	PAX9_Rabbit	1/50
	PDGFRa_Goat	1/100
	SCX_Rabbit	1/50
	TBX6_Goat	1/50
2 Антитела	Осел анти козье IgG(H+L) среднего antibody555	1/500
	Осел анти козье IgG(H+L) среднего antibody647	1/500
	Коза анти мыши IgG(H+L) среднего antibody555	1/500
	Коза анти кролик IgG(H+L) среднего antibody555	1/500
	Коза анти кролик IgG(H+L) среднего antibody647	1/500

Таблица 3: Первый и второй антитела для МУС.

Обсуждение

Хорошо известный метод для индукции PSC-производные SM через ПСМ является сочетание CHIR99021 + A83-01 (ингибитор TGFβ) во время индукции PSM от PSC, но не во время процесса созревания PSM⁶. В настоящем исследовании WNT/бета катенина сигнализации была тормозится используя C59 побудить см от PSM. Однако мы ввели использование CHIR99021 для того чтобы активировать путь WNT во время SM дифференциации. Данное решение принято на основании вывод, что несколько WNTs выражена в окружающих тканях SM и учитывая тот факт, что репортеры WNT активны в SM²⁰. В результате мы наблюдали, что эпителизации, характеристика SM в естественных условиях, только при условии, с CHIR99021, основанный на накопление CDH11 в ячейке узлов (рис. 2е). Это наблюдение указывает критическое участие WNT сигнализации во время PSM дифференциации и эпителизации SM, поэтому, что наш протокол может лучше пилки эндогенного сигнальную среду. Однако это также предполагает дополнительную возможность тонкой настройки WNT/бета катенина сигнальный путь во время дифференциация, потому, что надежность и эффективность дифференциации могут значительно отличаться в зависимости от типов клеток, клеточных линий и различные химические соединения WNT-индукторов, используемые каждый исследователь.

Этот метод также позволяет нам создавать все четыре SM производные, Миопатии, D, SCL и SYN, от человеческого iPSCs. Наша пошаговая протоколы, используя МЧР может использоваться для идентификации сигналов требований во время человека somitogenesis/Сомит кучность и обеспечивают важное понимание человеческого развития см. Например наши методы могут быть полезны для изучения сегментации часовые механизмы, молекулярных колебаний системы, которая регулирует формирование SM. Он тщательно исследовано в мышей, цыплят и данио рерио, но не в людей из-за отсутствия соответствующих экспериментальных средств.

Кроме того наш метод могут быть применимы к будущим клинической терапии на основе ячеек. Например человека iPSC производные D или SYN могут быть пересажены в сильно поврежденную кожу или разрыв сухожилия для регенерации и лечения. Однако некоторые ограничения должны быть решены до того, как этот метод может применяться практически. Хотя в настоящем исследовании, мы использовали клетки фидера SNL для iPSC обслуживание и решение ECM, которая добывается из Engelbreth-холм-Рой мыши саркомы, как поверхностный слой на блюдо во время индукции, эти не человеческого животного производные реагенты должны быть удалено для улучшения качества. Кроме того необходимо также совершенствовать клеток количество и качество, которое включает чистоты и созревания клеток желаемого. Кроме того не только количества клеток, но и прочность клеток является важной характеристикой для регенерации сухожилия/связки. Кроме того развитие поверхностных маркеров для очищения и новый метод для 3D воссоздание необходимы для того, чтобы наши протоколы по клинической терапии на основе ячеек.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALX4_Goat antibody	Santacruz	sc-22066
Apo-transferrin	Sigma	T1147
BMP4	R&D	314-BP-010
BMP7	R&D	354-BP-010
Bovine serum albumin	Sigma	A8806
Calcium chloride	Nacalai tesque	067730-15
CDH11_Mouse antibody	Cell signaling	13577
Cell streching device	Strex	STB-140
Chemically defined lipid concentrate	Gibco	11905-031
CHIR99021	Axon	1386
COL1A1_Rabbit antibody	Abcam	ab34710
COL2A1_Mouse antibody	Thermo scientific	MS-235
Collagenase IV	Thermofisher	17104019
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody	R&D	FAB1818A	For FACS
DMEM	Sigma	D6046
DMEM/F12	Gibco	11320-082
DMH1	Tocris	4126
EN1_Rabbit antibody	Abcam	ab70993
Fetal bovine serum	Nichirei	171012
FGF2	Wako	060-04543
FGF8	Peprotech	100-25
Human dermal fibroblast	Cell applications	160-05a
Human tenocyte	Angio proteomie	cAP-0041
Insulin	Wako	090-06474
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12	Gibco	21056023
Knockout SR	Gibco	10828028
LDN193189	Axon	1509
Matrigel	BD bioscience	354230	Artificial extracellular matrix
MEOX1_Rabbit antibody	Abcam	ab75895
MHC_Rabbit antibody	Santacruz	sc-20641
MKX_Rabbit antibody	Atlas antibodies	A83377
Monothioglycerol	Sigma	M6145
mTeSR1	Stemcell tech	85850
Multi well-type silicon rubber chamber	Strex	STB-CH-4W
MYOD_Rabbit antibody	Abcam	ab133627
MYOG_Mouse antibody	Santacruz	sc-12732
NKX3.2_Rabbit antibody	Sigma	HPA027564
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555	Invitrogen	A21432
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647	Invitrogen	A21447
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555	Invitrogen	A21422
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555	Invitrogen	A21428
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647	Invitrogen	A21245
PARAXIS_Rabbit antibody	Santacruz	sc-98796
PAX1_Rabbit antibody	Abcam	ab95227
PAX9_Rabbit antibody	Gene tex	GTX104454
PBS	-	-
PDGFRa_Goat	R&D	AF307
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Primate ES cell medium	Reprocell	RCHEMD001
SAG	Calbiochem	566661
SB431542	Selleckchem	SEL-S1067-10
SCX_Rabbit antibody	Abcam	ab58655
TBX6_Goat antibody	R&D	AF4744
Tendon cell growth medium	Angio-proteomie	cAP-40	Tenocytes growth medium
TGFβ3	R&D	243-B3-200
Trypsin	Gibco	15090046