Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

Riepilogo

Presentiamo qui un protocollo per la differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti indotte in ogni derivato di somite (Miotomo, sclerotomo, dermatome e syndetome) in condizioni chimicamente definite, che ha applicazioni nella modellazione di malattia futura e terapie basate su cellule in chirurgia ortopedica.

Abstract

In risposta a segnali quali WNT, bone morphogenetic proteins (BMPs) e sonic hedgehog (SHH) secernuto dai tessuti circostanti, somiti (SMs) danno luogo a più tipi di cellule, tra cui il miotomo (MYO), sclerotomo (SCL), dermatome (D) e syndetome (SYN) , che a sua volta trasformarsi in muscolo scheletrico, scheletro assiale, derma dorsale e assiale del tendine/legamento, rispettivamente. Pertanto, la generazione di SMs e loro derivati da cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) è fondamentale per ottenere cellule staminali pluripotenti (PSC) per applicazioni in medicina rigenerativa e per la ricerca di malattia nel campo della chirurgia ortopedica. Anche se i protocolli di induzione per MYO e SCL da PSC precedentemente sono stati segnalati da diversi ricercatori, nessuno studio ha ancora dimostrato l'induzione di SYN e D da iPSCs. Di conseguenza, induzione efficiente di SMs completamente competente rimane una sfida importante. Qui, abbiamo ricapitolare umano patterning di SM con iPSCs umane in vitro imitando l'ambiente segnalazione durante lo sviluppo di SM pulcino/mouse e relazione sui metodi di induzione sistematica dei derivati di SM (MYO, SCL, D e SYN) da iPSCs umane sotto chimicamente condizioni definite attraverso il mesoderm presomitic (PSM) e Stati di SM. Conoscenza per quanto riguarda lo sviluppo del pulcino/mouse SM è stato applicato con successo all'induzione di SMs con iPSCs umane. Questo metodo potrebbe essere un nuovo strumento per studiare umano somitogenesis e patterning senza l'uso di embrioni e per la modellazione di malattia e di terapia cellulare.

Introduzione

Lo sviluppo di un metodo di differenziazione diretto per un tipo di cella desiderata da sportelli unici è un passo necessario per tradurre lo studio di cellule derivanti dal PSC in applicazioni cliniche. Sovraespressione di geni chiave è una strategia promettente per organo-differenziamento da PSC e ha migliorato la nostra comprensione della regolazione genetica della determinazione del destino cellulare, la morfogenesi organo e organizzazione durante l'embriogenesi¹. Inoltre, ricapitolare gli ambienti segnalazione endogeni, mediante lo sviluppo di embrioni di topo e pulcino come una tabella di marcia, è considerato essenziale per la differenziazione diretto degli sportelli unici. Tuttavia, la strategia di quest'ultima dato l'applicazione di cellule derivanti dal PSC in studi clinici come terapie basate sulle cellule, è più adatta perché non richiede la manipolazione genica.

Parecchi studi hanno riferito l'induzione del mesoderma dall'essere umano e del mouse PSC in condizioni definite chimicamente. In genere, questi metodi hanno invocato activin/nodale/trasformando la segnalazione di β (TGFβ) fattore di crescita e ossea morfogenetica (BMP) di segnalazione, creduto per eseguire la differenziazione meso-endoderma e mesoderma, conseguente a un'efficienza bassa induzione del il parassiale mesoderma (20% circa)². In altre parole, il mesoderma PSC-derivato indotto da queste vie di segnalazione è stato principalmente mesoderma della piastra laterale e non il mesoderma parassiale. Recentemente, alcuni studi hanno dimostrato la produzione efficiente di mesoderma parassiale PSC-derivato basato su diverse strategie^3,4,5,6,7,8 . In questi studi, gli sportelli unici sono stati coltivati con concentrazioni relativamente alte di chinasi 3 (GSK3) di glicogeno sintasi inibitori (attivatori di segnalazione WNT), di conseguenza l'efficienza di induzione del mesoderma parassiale raggiunto 70% – 95%^6,7 .

In somitogenesis, il mesoderma parassiale prima forma mesoderm presomitic (PSM) posteriormente e quindi costituisce somiti (SMs) nella parte anteriore attraverso transizione mesenchima--epiteliale^9,10. Ligando tacca del Delta-tipo 1 (DLL1) è noto per avere un ruolo fondamentale durante la somitogenesis, come controllo oscillatoria dell'espressione DLL1, sia a livello di mRNA e proteine, regola la segmentazione SM. SMs alla fine suddividere in due parti, dando luogo a dermomyotome (DM), dorsalmente e sclerotomo (SCL) ventralmente¹¹. Successivamente, il DM si differenzia in dermatome (D), un precursore del derma e Miotomo (MYO), un precursore del muscolo scheletrico; Inoltre, una porzione ventrale del SCL forma syndetome (SYN), un precursore di tendini e legamenti¹² (Figura 1). Alcuni ricercatori hanno segnalato l'induzione di derivati di PSC-derivato SM come MYO^4,13 e SCL¹⁴; Tuttavia, ci sono diverse limitazioni in questi studi. In particolare, dal momento che la nostra conoscenza degli ambienti segnalazione di D e SYN è frammentario, protocolli di induzione per D e SYN non sono ancora state sistematicamente stabilite. Per dimostrare la competenza completa di SMs indotta da sportelli unici, è essenziale per mostrare la multi-differenziazione capacità di SMs indotta in tutti e quattro i derivati (D, MYO, SCL e SYN), mentre gli studi precedenti si sono concentrati solo su specifici derivati di SM. Qui, segnaliamo su come generare tutti i quattro derivati di SM, anche D e SYN, attraverso destini PSM e SM da umano iPSCs¹⁵. Siamo convinti che stabilire un metodo graduale in vitro che modella il processo di sviluppo di SM potrebbe contribuire allo studio della SM come umano si sviluppa durante l'embriogenesi, senza l'utilizzo di embrioni.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali che coinvolgono iPSCs umane sono stati approvati dal comitato etico del dipartimento di medicina e Graduate School of Medicine, Università di Kyoto.

1. umani iPSCs preparazione prima di induzione

Nota: Cultura umana iPSCs (201B7-PAX3-GFP) sull'alimentatore SNL cellule¹⁶ con medium cellulare primate ES completati con 4 ng/mL di fattore di crescita fibroblastico ricombinante umano base (FGF2) e 0,5%, penicillina e streptomicina (in seguito denominato come mezzo di hESC, vedere Tabella 1). Quando il rapporto di confluenza raggiunge 70% – 80%, passaggio le celle come descritto in precedenza¹⁷.

1. Passaggio di umano iPSCs su SNL alimentatore cellule¹⁷
   1. Per passaggio, aggiungere PBS nella piastra di coltura delle cellule e sciacquare le cellule. Quindi, rimuovere il PBS (, questo processo sarà essere appresso come lavaggio con PBS).
   2. Aggiungere 1 mL di soluzione CTK (Vedi tabella 1) a temperatura ambiente (RT) e attendere che le cellule di alimentatore SNL iniziare lo scollegamento dalla parte inferiore del piatto.
   3. Rimuovere la soluzione CTK e poi lavare due volte con PBS.
   4. Aggiungere 1 mL di medium hESC (Vedi tabella 1) nel piatto, poi raschiare le celle utilizzando un raschietto e raccogliere in una provetta conica da 15 mL.
   5. Pipettare delicatamente il contenuto cinque volte usando una punta di 1.000 µ l e poi il trasferimento a un nuovo piatto riempito con il mezzo di hESC. Utilizzare un rapporto di divisione di 1:4 a 01:10, a seconda della percentuale di confluenza prima di passaggio. Inoltre, variare il volume del mezzo hESC a seconda dell'entità del piatto (ad esempio, 3 mL per un piatto di cm 6, 8ml per un piatto di 10 cm).
   6. Incubare le iPSCs umane a 37 ° C e 5% CO₂.
   7. Cambiare il medio tutti i giorni (tranne il giorno dopo passaggio) e le cellule della coltura fino a quando la prossima procedura passaging.
2. Senza alimentatore coltura delle iPSCs umane prima di induzione di PSM
   Nota: per ridurre al minimo l'effetto di fattori di crescita secernuta dalle cellule di alimentatore SNL, cultura il iPSCs umane nelle circostanze senza alimentatore con un mezzo di coltura privo di alimentatore cellulare (Vedi tabella 1) su soluzioni di matrice extracellulare (ECM) (Vedi tabella 1) piatto rivestito per 3 giorni prima di induzione di PSM.
   1. Giorno -4 (4 giorni prima di iniziare ad induzione PSM)
      1. Per preparare il piatto di rivestite con soluzione di ECM, aggiungere 4 mL di soluzione di ECM su un piatto di 10 cm a 4 ° C durante la notte.
         Nota: Mettere la soluzione ECM sul ghiaccio durante la preparazione.
   2. Giorno -3
      1. Innanzitutto, rimuovere la soluzione ECM dal piatto e aggiungere 8 mL di mezzo di coltura cellulare privo di alimentatore.
      2. Per avviare l'alimentatore senza coltura, lavare una volta con PBS per lavare le cellule coltivate.
      3. Aggiungere 1 mL di soluzione CTK presso RT fino a quando le cellule di alimentatore SNL iniziano lo scollegamento dalla parte inferiore del piatto.
         Nota: Utilizzare la microscopia per confermare che tutte le cellule di alimentatore sono staccate dal fondo.
      4. Rimuovere la soluzione CTK e lavati con PBS due volte, affinché tutte le cellule di alimentatore SNL vengono completamente rimossi.
      5. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura privo di alimentatore cellulare nel piatto, poi raschiare le celle utilizzando un raschietto e raccoglierle in una provetta conica da 15 mL.
      6. Delicatamente Pipettare il contenuto tre volte usando una punta di 1.000 µ l, poi il trasferimento a un nuovo piatto di 10cm rivestite con soluzione di ECM (preparato durante passaggio 1.2.1). Utilizzare un rapporto di divisione di circa 1:2 a 1:4, a seconda della percentuale di confluenza prima coltura privo di alimentatore.
      7. Incubare le iPSCs umane a 37 ° C e 5% CO₂ per 3 giorni, cambiando il mezzo giorno -1.

2. PSM differenziazione e isolamento di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS)

1. Differenziazione di PSM (giorno 0 – giorno 4)
   1. Aspirare il terreno di coltura cellulare privo di alimentatore e aggiungere 8 mL di mezzo di induzione di PSM (medium basale CDM supplementato con 10 µM SB431542, µM 10 CHIR99021, 2 µM DMH1 e 20 ng/mL FGF2, Vedi tabella 1).
      Nota: Confluenza di cella all'inizio della differenziazione di PSM è fondamentale per l'efficienza di induzione. Utilizzare la microscopia per confermare che il rapporto confluente è circa il 30%.
   2. Incubare le cellule a 37 ° C, con 5% di CO₂, per 4 giorni, cambiando il mezzo il giorno 3.
   3. Raccogliere le cellule per FACS il giorno 4 (sezione 2.2, sotto).
2. Isolamento di cellule positive di PSM DLL1 di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS)
   Nota: qui di seguito è una procedura per la preparazione delle cellule prima FACS l'ordinamento delle cellule positive DLL1. Eseguire un FACS ordinamento utilizzando un citometro a flusso, secondo il protocollo del produttore.
   1. Aspirare il mezzo, quindi lavare con PBS. Successivamente, aggiungere 1 mL di reagente di dissociazione delle cellule e lasciare per 3 minuti a TA.
   2. Aggiungere 4 mL di sostanza basale CDM, raschiare le celle utilizzando un raschietto e raccoglierle in una provetta conica da 15 mL.
   3. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato, quindi centrifugare a 280 x g per 3 min.
   4. Attentamente l'aspirazione per rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in buffer di FACS (Vedi tabella 1) ad una concentrazione di 1,0 x 10⁷ cellule/mL. Per un campione di controllo negativo (controllo di isotipo, o in convenzione senza anticorpo), trasferire 50 µ l in una provetta conica da 15 mL e quindi sospendere con 450 µ l di tampone di FACS.
   5. Aggiungere DLL1 anticorpo (Vedi Tabella materiali) in un rapporto di 1/200. Proteggere il tubo da luce e tenere il ghiaccio per 30 min.
   6. Centrifuga a 280 x g per 3 min.
   7. Attentamente, aspirare il supernatante e risospendere in tampone di FACS (1.0 x 10⁷ cellule/mL) completati con 1 mg/mL DAPI.
   8. Trasferimento in una provetta di raccolta, incorporata con una maglia di nylon 35 µm nel tappo per il filtraggio, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando l'ordinamento è completo. Eseguire la stessa procedura con il campione di controllo negativo (passo 2.2.4).
   9. Eseguire l'ordinamento utilizzando un citometro a flusso secondo il protocollo del produttore.
   10. Raccogliere le cellule positive DLL1 ordinate in una provetta conica da 15 mL, contenente 4 mL di medium basale CDM supplementato con 10 µM di Y27632. Per estrazione di RNA totale, centrifugare a 280 x g per 3 minuti poi risospendere in buffer di lisi di RNA e conservare a-30 ° C. Vedere l'estrazione del RNA, retrotrascrizione e RT-qPCR procedure (vedere paragrafo 5.1) per informazioni più dettagliate.
   11. Eseguire la differenziazione di SM usando le cellule ordinate secondo la sotto protocollo (sezione 3).

3. SM differenziazione da PSM

1. Differenziazione di SM da cellule positive PSM DLL1 ordinate (giorno 4 – giorno 8)
   Nota: preparare le piastre 12-pozzetti rivestite con soluzione di ECM il giorno prima dell'ordinamento FACS. Per preparare un piatto 12-pozzetti rivestite con soluzione di ECM, aggiungere 1 mL di soluzione di ECM in ogni pozzetto a 4 ° C e lasciare durante la notte. Mantenere la soluzione ECM sul ghiaccio durante la preparazione.
   1. Seguendo passo 2.2.10, centrifugare a 280 x g per 3 min.
   2. Attentamente aspirare il supernatante e risospendere in 1 mL di mezzo di induzione di SM (medium basale CDM supplementato con 10 µM SB431542 e 5 µM CHIR99021, Vedi tabella 1).
   3. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
   4. Cellule di seme 1.0 x 10⁵ su ciascun pozzetto delle contenente 1 mL di medium di induzione SM supplementato con 10 µM di Y27632 piastre 12-pozzetti rivestite con soluzione ECM.
   5. Incubare a 37 ° C con 5% CO₂ per 4 giorni fino al giorno 8. Modificare il mezzo non contenenti Y27632 il giorno 5 (il giorno dopo l'ordinamento FACS) e giorno 7.
   6. Eseguire la differenziazione di derivati SM utilizzando cellule indotte SM secondo i seguenti protocolli. Per estrazione di RNA totale da cellule indotte SM, raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 280 x g per 3 min, poi risospendere in buffer di lisi di RNA e conservare a-30 ° C.

4. SM derivati (DM, MYO, D, SCL, SYN) differenziazione da SM

Nota: Per dimostrare la competenza completa delle cellule di SM, in primo luogo eseguire DM (dermomyotome) e SCL (sclerotomo) induzione di conseguenza utilizzando cellule di SM iPSC-derivate. Successivamente, eseguire MYO (Miotomo) e D (dermatome) induzione usando le cellule di DM e condurre ad induzione di SYN (syndetome) usando le cellule SCL. Di seguito sono i protocolli per l'induzione di ogni derivato (DM, MYO, D, SCL e SYN) da cellule SM indotte in vitro.

1. DM differenziazione dalle cellule SM (giorno 8 – giorno 11)
   1. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo di induzione di DM (medium basale CDM completate con 5 µM CHIR99021 e 10 ng/mL BMP4, Vedi tabella 1).
   2. Incubare le cellule a 37 ° C, con 5% di CO₂, per 3 giorni fino al giorno 11. Modificare il mezzo il giorno 10 (giorno 2 del DM induzione).
   3. Eseguire MYO e D differenziazione utilizzo hanno indotto le cellule DM secondo i seguenti protocolli.
2. Differenziazione di MYO dalle cellule DM (giorno 11 – giorno 41)
   1. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo di induzione di MYO (medium basale CDM completate con 5 µM CHIR99021, Vedi tabella 1).
   2. Incubare le cellule a 37 ° C, con 5% di CO₂, per 30 giorni fino al giorno 41. Modificare il mezzo ogni 3 giorni.
3. Differenziazione dalle cellule DM (giorno 11 – giorno 20) D
   1. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo di induzione D (medium basale CDM completate con 5 µM CHIR99021 e 10 ng/mL BMP4, Vedi tabella 1).
   2. Incubare le cellule a 37 ° C, con 5% di CO₂, per 9 giorni fino al giorno 20. Modificare il mezzo ogni 3 giorni.
4. Differenziazione di SCL dalle cellule SM (giorno 8 – giorno 11)
   1. Aspirare il mezzo, quindi aggiungere 1 mL di mezzo di induzione di SCL (medium basale CDM completate con 100 nM SAG e 0,6 µM LDN193189, Vedi tabella 1)¹⁴.
   2. Incubare le cellule a 37 ° C, con 5% di CO₂, per 3 giorni. Modificare il mezzo il giorno 10 (induzione di giorno 2 di SCL).
   3. Eseguire la differenziazione di SYN utilizzando cellule indotte SCL secondo il protocollo sottostante.
5. Differenziazione di SYN da cellule SCL (giorno giorno 11 – 32)
   Nota: preparare le piastre 24 pozzetti rivestite con soluzione di ECM il giorno prima dell'inizio di induzione di SYN. Per preparare un piatto 24 pozzetti rivestite con soluzione di ECM, aggiungere 0,5 mL di soluzione di ECM in ogni pozzetto a 4 ° C e lasciare durante la notte. Mantenere la soluzione ECM sul ghiaccio durante la preparazione.
   1. Aspirare il mezzo e poi lavare con PBS, poi aggiungere 0,2 mL di reagente di dissociazione delle cellule in ciascun pozzetto e lasciare per 3 minuti a TA.
   2. Aggiungere 0,8 mL di sostanza basale CDM in ciascun pozzetto quindi raschiare e raccogliere tutte le cellule in una provetta conica da 15 mL.
   3. Centrifuga a 280 x g per 3 min.
   4. Attentamente aspirare il supernatante e risospendere in 1 mL di SYN induzione media-1 (media basale CDM addizionata di 20 ng/mL FGF8, Vedi tabella 1), poi contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
   5. ⁴ cellule di seme 5,0 x 10 in tutti i pozzetti delle contenente 1 mL di SYN induzione media-1 piastre 24 pozzetti rivestite con soluzione ECM.
   6. Incubare a 37 ° C, con 5% di CO₂, per 3 giorni.
   7. Il giorno 14 (induzione di giorno 3 di SYN), sostituire il mezzo con SYN induzione medio-2 (medium basale CDM supplementato con 10 ng/mL BMP7 e 10 ng/mL TGFβ3, Vedi tabella 1).
   8. Incubare a 37 ° C, con 5% di CO₂, per 18 giorni fino al giorno 32. Modificare il mezzo ogni 3 giorni.

5. caratterizzazione dei derivati dell'iPSC

Nota: Differenziamento, caratterizzano iPSCs umana derivati mediante PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR), immunocitochimica (ICC), analisi enzima-collegate dell'immunosorbente (ELISA) e le analisi di stimolazione meccanica elasticizzato, di conseguenza.

1. Colture di cellule, estrazione di RNA totale, trascrizione d'inversione e analisi quantitativa in tempo reale di PCR (RT-qPCR)
   1. Raccogliere i campioni di cellule (procedure 2.2.10, 3.1.6, 5.4.3) in una provetta da 1,5 mL, poi Centrifugare a 280 x g per 3 min.
   2. Eliminare il surnatante, quindi risospendere in 350 µ l di tampone di lisi di RNA, fornito da un apposito kit di estrazione di RNA totale.
   3. Estrarre RNA totale usando il kit secondo il protocollo del produttore.
   4. Retromarcia trascrivere l'isolato 1 µ g di RNA totale di cDNA, secondo il protocollo del produttore.
   5. Eseguire RT-qPCR utilizzando enzimi adatti, reagenti e primer secondo il protocollo del produttore. Le sequenze dell'iniettore utilizzate in questo studio sono riportate nella tabella 2.
2. Immunocitochimica (ICC)
   1. Prima di eseguire immunocitochimica con anticorpi, fissare le cellule con 2% paraformaldeide al 4 ° C per 10 min e lavare due volte con PBS.
   2. Per la permeabilizzazione, incubare con metanolo 0,2% o 0,2% polisorbato 20/PBS (in appresso denominato "PBS-T") a 4 ° C per 15 min.
   3. Rimuovere i reagenti di permeabilizzazione e trattare le cellule con un adeguato blocco buffer o 1% bovina siero albumina/PBS a 4 ° C per 60 min.
   4. Aggiungere il primo anticorpo diluito con il tampone bloccante 10% in PBS-T e posto su una macchina d'agitazione a 4 ° C durante la notte.
   5. Lavare tre volte con PBS-T (aggiungere PBS-T e appoggiare sulla macchina d'agitazione a temperatura ambiente per 10 min).
   6. Aggiungere il secondo anticorpo, diluito con il tampone bloccante 10% in PBS-T e posto sulla macchina agitazione a temperatura ambiente per 60 min. Gli anticorpi primi e la secondo per ICC utilizzato in questo studio sono riportati nella tabella 3.
      Nota: Da questo punto in poi, è necessario proteggere il piatto/piatto dalla luce avvolgendolo in un foglio.
   7. Lavare due volte con PBS-T.
   8. Per la colorazione del contatore, aggiungere 1/5000 DAPI diluito con PBS e posto sulla macchina agitazione a temperatura ambiente per 5 min.
   9. Rimuovere la soluzione DAPI e aggiungere PBS in ciascun pozzetto.
   10. Osservare la colorazione delle cellule usando un microscopio a fluorescenza. In alternativa, è possibile memorizzare il piatto/piatto a 4 ° C per 1 mese.
3. Enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per l'analisi funzionale di iPSC-derivato D
   Nota: cellule di fibroblasti cutanei umani (HDF) sono disponibili in commercio. Cultura di HDF in DMEM completati con 10% siero bovino fetale (Vedi tabella 1).
   1. Le cellule di seme 1.0 x 10⁵ di iPSC-derivato D e HDF sui 24 pozzetti contenente 1 mL di ogni mezzo di coltura (mezzo di induzione: d: D, HDF: DMEM completati con 10% siero bovino fetale).
   2. Dopo 3 giorni di coltura cellulare, raccogliere 100 µ l di ciascun mezzo, posto in una provetta da 1,5 mL e conservare a 4 ° C.
   3. Eseguire la serie di procedure, come l'aggiunta di rilevamento anticorpi e anticorpi secondari, secondo le istruzioni del fabbricante e quantificare il numero di bersagli generando una curva standard contro la concentrazione del controllo campioni di analita.
4. Analisi di stimolazione stretch meccanico per l'analisi funzionale di SYN iPSC-derivato
   Nota: tenociti umani adulti sono commercialmente disponibili (Vedi Tabella materiali). Cultura umana iPSC-derivato SYN e tenociti adulto umano su una cella che si estende di dispositivo per il test di stimolazione meccanica elasticizzato come descritto di seguito^18,19. Terreno uso SYN induzione medio-2 e tenociti crescita (Vedi Tabella materiali) come mezzo di coltura per ogni derivato iPSC SYN e tenociti umano adulto, rispettivamente.
   1. A 24 h prima dell'allungamento, piastra 1.0 x 10⁵ cellule di SYN iPSC-derivato e tenociti umano sulla gomma di pozzo-tipo silicone multi rivestite con soluzione ECM chambers, ciascuno con una superficie di cultura di 1,5 x 1,5 cm (Vedi Tabella materiali).
   2. Impostare gli alloggiamenti sul dispositivo per l'allungamento delle cellule e forza deformazione ciclica monoassiale (0,5 Hz, 5%) per 12 h.
   3. Per estrazione di RNA totale, 350 µ l di tampone di lisi del RNA, poi raschiare e raccogliere le cellule in una provetta da 1,5 mL per estrazione di RNA totale e la successiva analisi di RT-qPCR (vedi procedura 5.1).

Risultati

Tutte le figure in questo rapporto sono state ottenute con 201B7-PAX3-GFP iPSCs, in cui EGFP sostituisce un allele della sequenza di codificazione PAX3 in essone 1. Istituzione di 201B7-PAX3-GFP iPSCs sarà descritto altrove (H. Sakurai, comunicazione personale). La significatività statistica è stata valutata utilizzando il software statistico. Valori di P inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.

Caratterizzazione di cellule umane derivate iPSC PSM e SM
Per valutare la differenziazione delle iPSCs umane verso SM attraverso lo stato PSM (Figura 2A), analisi di FACS, sono state eseguite analisi di ICC e l'analisi di RT-qPCR. Come illustrato nella Figura 2B, oltre l'85% delle cellule erano positive per DLL1, un marker di PSM, ma la negazione per PAX3, un indicatore di SM, dopo 4 giorni di induzione di PSM con iPSCs umane. Successivamente, questa popolazione è diventato PAX3 cellule positive di SM dopo 4 giorni di induzione di SM. La transizione di PSM-SM è stata confermata anche da ICC (Figura 2) e RT-qPCR (Figura 2D). TBX6, MSGN1 e WNT3A, marcatori PSM erano espressa presso lo stato PSM (giorno 4), ma non espressa presso lo stato di SM (giorno 8). PARAXIS, MEOX1 e PAX3, marcatori di SM, erano espressi al SM, ma non espresse a PSM. Inoltre, solo la macchiatura di CDH11, un indicatore di SM epithelialized, accumulato allo svincolo cellula-cellula, dopo l'aggiunta di SB431542 con CHIR99021 (Figura 2E).

Caratterizzazione dei derivati di SM indotta da cellule SM iPSC-derivate essere umano
Per valutare la potenza di differenziazione di SM iPSC-derivati umani, differenziazione verso DM, MYO, D, SCL e SYN (Figura 3A) è stata valutata tramite analisi di ICC e PAX3 (GFP)-fluorescenza. Come illustrato in Figura 3B, DM differenziazione è stata confermata da ALX4 ed EN1 macchiatura e PAX3 (GFP)-fluorescenza; Differenziazione di MYO è stata confermata dalla catena pesante MYOD, MYOG e della miosina (MHC) colorazione; D differenziazione è stata confermata da EN1 e PDGFRa colorazione; Differenziazione di SCL è stata confermata da PAX1, PAX9 e NKX3.2 colorazione; e differenziazione di SYN è stata confermata da SCX, MKX, COL1A1 e COL1A2 macchiatura.

Caratterizzazione di indotto D e SYN
1. enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) per analisi funzionale dell'iPSC-derivato D
Nel corpo umano, una delle funzioni primarie di fibroblasti cutanei è di secernere proteine della matrice extracellulare (ECM), come il collagene e acido ialuronico che idrata la pelle e contribuire a sostenere la struttura della pelle. Per dimostrare che una quantità paragonabile di proteine di collagene di tipo 1 e acido ialuronico sono stati secernuti nel terreno di coltura di iPSC-derivato D e HDF, ELISA è stata eseguita, come mostrato in Figura 4A.

2. analisi di stimolazione per l'analisi funzionale di SYN iPSC-derivato stretch meccanico
Come diversi studi hanno già segnalato, stimolazione meccanica colpisce lo sviluppo di tendine prima e dopo la nascita e promuove la differenziazione dei tenociti dal precursore cellule^18,19. Pertanto, è ben noto che la reattività allo stress meccanico è una delle caratteristiche di tenociti. Per dimostrare la reattività paragonabile di SYN iPSC-derivato umano e umano adulto tenociti, è stato eseguito un dosaggio di stimolazione meccanica elasticizzato come mostrato in Figura 4B.

Figura 1: rappresentazione schematica di differenziazione gerarchica del mesoderma parassiale. Mesoderm presomitic è una popolazione di cellule che transitoriamente emerge durante l'embriogenesi precoce e subisce la segmentazione per somiti forma. Somiti sono una popolazione di cellule staminali transitoria che dà luogo a diversi tipi di cellule, come cellule sclerotomo, dermomyotome, syndetome, dermatome e Miotomo, che alla fine si differenziano in tendine/legamento, osso/cartilagine, muscolo scheletrico e derma cellule. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: analisi FACS, RT-qPCR e ICC di PSM iPSC-derivati umani e cm. (A) rappresentazione schematica di un protocollo per il differenziamento di SM attraverso PSM. (B) trama punto rappresentativo di colorazione DLL1 e PAX3 (GFP)-fluorescenza il giorno 4 (giorno 8 da iPSC) di induzione di SM e 4 di induzione di PSM. (C) rappresentante immunocytochemical immagini e PAX3 (GFP)-fluorescenza il giorno 4 (giorno 8 da iPSC) di induzione di SM e 4 di induzione di PSM. Le cellule sono state colorate con anti-TBX6, PARAXIS e MEOX1 anticorpi (rosso) e rilevati con PAX3 (GFP) o co-macchiato con DAPI (blu)-fluorescenza (verde). (D) analisi di RT-qPCR di marcatori per PSM e SM presso iPSC, PSM e SM. L'errore di standard ± di mezzi (S.E.) da tre serie di esperimenti sono mostrati. (E) rappresentante immunocytochemical immagini il giorno 4 (giorno 8 da iPSC) di SM, coltivate in S10I10 (combinazione di SB431542 e IWR1, un inibitore di segnalazione WNT), S10 (SB431542) e S10C5 le condizioni (combinazione di SB431542 e CHIR99021). Le cellule erano macchiate con l'anticorpo anti-CDH11 (rosse) e co-macchiate con DAPI (blu). iPS, cellule staminali pluripotenti indotte; PSM, mesoderm presomitic; SM, somite; S10, SB431542 10 ΜM; C5, CHIR99021 5 ΜM; I10, IWR1 10 ΜM; Scala bar = 50 μm. Questa figura è stata modificata da Nakajima et al (2018)¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: analisi di ICC di DM, MYO, D, SCL e SYN differenziato da mq. iPSC-derivati umani (A) rappresentazione schematica dei protocolli per il differenziamento di derivati di SM. (B) rappresentante immunocytochemical immagini e PAX3 (GFP)-fluorescenza il giorno 3 (giorno 11 da iPSC) di induzione di DM, giorno 30 (giorno 41 da iPSC) di induzione di MYO, giorno 9 (giorno 20 da iPSC) di induzione D, giorno 3 (giorno 11 da iPSC) di induzione SCL e giorno 21 (giorno 32 da iPSC) di induzione di SYN. DM, le cellule erano macchiate di EN1 anticorpi (rosso) e anti-ALX4 e co-macchiate con DAPI (blu) o rilevate con PAX3 (GFP)-fluorescenza (verde); MYO, le cellule sono state colorate con anti-MYOD, MYOG (rosso) e gli anticorpi di MHC (ciano), anche co-macchiati con DAPI (blu); S, cellule erano macchiate con gli anticorpi PDGFRa (ciano) e anti-EN1 (rosso) e co-macchiate con DAPI (blu); SCL, le cellule erano macchiati con anti-PAX1, PAX9 e NKX3.2 anticorpi (rossi) e co-macchiato con DAPI (blu); SYN, le cellule erano macchiati con anti-SCX, MKX, COL1A1 e COL1A2 anticorpi (rossi) e co-macchiato con DAPI (blu). DM, dermomyotome; MYO, Miotomo; D, dermatome; SCL, sclerotomo; SYN, syndetome; Scala bar = 50 μm. Questa figura è stata modificata da Nakajima et al (2018)¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: analisi funzionale di indotto D e SYN. (A) la quantità di collagene di tipo 1 e acido ialuronico proteine nel terreno di coltura sono stati analizzati da ELISA. (B) l'effetto di stiramento meccanico stimolazione indotta SYN e tenociti adulto umano è stata valutata da RT-qPCR. L'errore di standard ± di mezzi (S.E.) da tre serie di esperimenti sono mostrati. * p < 0,05; * * p < 0.01; p < 0,001 di Dunnett più confronti t-test rispetto al tratto (-); Nardo, non significativo, HDF, umano adulto dei fibroblasti cutanei. Questa figura è stata modificata da Nakajima et al (2018)¹⁵. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Medio/soluzione	Reagant	Concentrazione
Medio basale CDM	Iscove per volta F12 medio/prosciutto di Dulbecco	1:1
	Penicillina/streptomicina	0,5%
	Concentrato di lipidi di costituzione chimica definita	1%
	APO-transferrina	15 mg/mL
	Monothioglycerol	450 mM
	Albumina di siero bovino	5 mg/mL
	Insulina	7 mg/mL
Soluzione CTK	Acqua	-
	Tripsina	0,25%
	Collagenasi IV	0,1 mg/mL
	Cloruro di calcio	1 mM
	Knockout SR	20%
Mezzo di induzione di D	Medio basale CDM	-
	CHIR99021	5 ΜM
	BMP4	10 ng/mL
Mezzo di induzione di DM	Medio basale CDM	-
	CHIR99021	5 ΜM
	BMP4	10 ng/mL
Soluzione di ECM	Matrice extracellulare artificiale	0,3 mg/mL
	DMEM/F12	-
Buffer di FACS	PBS	-
	Albumina di siero bovino	0,1%
Mezzo di coltura cellulare privo di alimentatore	mTeSR1	-
	Penicillina/streptomicina	0,5%
Terreno di coltura HDF	DMEM	-
	Siero bovino fetale	10%
hESC medio	Mezzo di primate ES cellulare	-
	Penicillina/streptomicina	0,5%
	FGF2	4 ng/mL
Mezzo di induzione di MYO	Medio basale CDM	-
	CHIR99021	5 ΜM
Mezzo di induzione di PSM	Medio basale CDM	-
	SB431542	10 ΜM
	CHIR99021	10 ΜM
	DMH1	2 ΜM
	FGF2	20 ng/mL
Mezzo di induzione di SCL	Medio basale CDM	-
	SAG	100 nM
	LDN193189	0,6 ΜM
Mezzo di induzione di SM	Medio basale CDM	-
	SB431542	10 ΜM
	CHIR99021	5 ΜM
SYN induzione media-1	Medio basale CDM	-
	FGF8	20 ng/mL
SYN induzione medio-2	Medio basale CDM	-
	BMP7	10 ng/mL
	TGFΒ3	10 ng/mL

Tabella 1: Ricette di Media e soluzione.

NOME	Avanti	Invertire
ACTB	CACCATTGGCAATGAGCGGTTC	AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
COL1A1	GGACACAGAGGTTTCAGTGGT	GCACCATCATTTCCACGAGC
MEOX1	GAGATTGCGGTAAACCTGGA	GAACTTGGAGAGGCTGTGGA
MSGN1	GGAGAAGCTCAGGATGAGGA	GTCTGTGAGTTCCCCGATGT
PARAXIS	TCCTGGAGAGCTGTGAGGAT	CACACCCTGTCACCAACAGT
PAX3	AGGAAGGAGGCAGAGGAAAG	CAGCTGTTCTGCTGTGAAGG
SCX	CCCAAACAGATCTGCACCTTC	GCGAATCGCTGTCTTTCTGTC
TBX6	AGCCTGTGTCTTTCCATCGT	AGGCTGTCACGGAGATGAAT
TNMD	CCCTTCATGCTGAAGCCACTT	CTCACTTTCAGCAGAATTGGGG
WNT3A	CAAGATTGGCATCCAGGAGT	ATGAGCGTGTCACTGCAAAG

Tabella 2: Sequenze Primer per l'analisi di RT-qPCR.

		Concentrazione
1 ° Anticorpo	ALX4_Goat	1/50
	CDH11_Mouse	1/1000
	COL1A1_Rabbit	1/100
	COL2A1_Mouse	1-2 μg/mL
	EN1_Rabbit	1/50
	MEOX1_Rabbit	1/50
	MHC_Rabbit	1/200
	MKX_Rabbit	1/50
	MYOD_Rabbit	1/500
	MYOG_Mouse	1/400
	NKX3.2_Rabbit	1/50
	PARAXIS_Rabbit	1/50
	PAX1_Rabbit	1/50
	PAX9_Rabbit	1/50
	PDGFRa_Goat	1/100
	SCX_Rabbit	1/50
	TBX6_Goat	1/50
2 ° Anticorpo	Asino anti-capra IgG(H+L) secondaria antibody555	1/500
	Asino anti-capra IgG(H+L) secondaria antibody647	1/500
	Capra anti-Mouse IgG(H+L) secondaria antibody555	1/500
	Capra anti-coniglio IgG(H+L) secondaria antibody555	1/500
	Capra anti-coniglio IgG(H+L) secondaria antibody647	1/500

Tabella 3: Primo e secondo gli anticorpi per ICC.

Discussione

Un metodo ben noto per l'induzione del PSC-derivato SM attraverso PSM è la combinazione di CHIR99021 + A83-01 (inibitore di TGFβ) durante l'induzione di PSM dal PSC, ma non durante il processo di maturazione PSM⁶. Nello studio presente, la segnalazione WNT/beta-catenina è stata inibita utilizzando C59 per indurre SM da PSM. Tuttavia, abbiamo introdotto l'uso di CHIR99021 per attivare la via di WNT durante la differenziazione di SM. Questa decisione è stata fatta basato sulla constatazione che diversi Wnt sono espressi nei tessuti circostanti di SM e dato il fatto che i giornalisti WNT sono attivi nella SM²⁰. Di conseguenza, abbiamo osservato epithelialization, una caratteristica della SM in vivo solo sotto la condizione con CHIR99021, basato sull'accumulo di CDH11 in giunzioni della cellula-cellula (Figura 2E). Questa osservazione indica il coinvolgimento critico di WNT segnalazione durante la differenziazione di PSM ed epithelialization SM, quindi il nostro protocollo può meglio ricapitolare l'ambiente segnalazione endogena. Tuttavia, essa implica anche un'ulteriore possibilità di messa a punto la durante il differenziamento, la via di segnalazione WNT/beta-catenina perché la robustezza e l'efficienza della differenziazione potrebbe variare notevolmente a seconda i tipi cellulari, linee cellulari e vari composti chimici di WNT-induttori utilizzati da ciascun ricercatore.

Questo metodo permette anche di generare tutti i quattro SM derivati, MYO, D, SCL e SYN, da iPSCs umane. I nostri protocolli graduale utilizzando CDM possono essere utilizzati per identificare i requisiti di segnalazione durante umano somitogenesis/somite patterning e forniscono le comprensioni importanti sullo sviluppo dei SM. Ad esempio, i nostri metodi potrebbero essere utili per studiare i meccanismi di segmentazione dell'orologio, un sistema di oscillazione molecolare che regola la formazione di SM. È stato accuratamente studiato in topi e pulcini in zebrafish, ma non in esseri umani a causa della mancanza di adeguati strumenti sperimentali.

Inoltre, il nostro metodo può essere applicabile a future terapie basate sulle cellule cliniche. Ad esempio, D iPSC-derivati umani o SYN possono essere trapiantati in pelle gravemente danneggiata o tendini per la rigenerazione e trattamento. Tuttavia, numerose limitazioni devono essere risolti prima che questo metodo può essere applicato praticamente. Anche se nel presente studio, abbiamo usato le cellule di alimentatore SNL per iPSC manutenzione e soluzione di ECM, che viene estratta dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm, come un rivestimento superficiale sul piatto durante l'induzione, questi reagenti di derivazione animale non umano dovrebbero essere rimosso per migliorare la qualità clinica. Inoltre, la cella quantità e qualità, che comprende la purezza e la maturazione delle cellule desiderate, inoltre deve essere migliorati. Inoltre, non solo il numero di cellulare, ma anche la forza delle cellule è una caratteristica importante per la rigenerazione del legamento/del tendine. Inoltre, lo sviluppo di marcatori di superficie per purificazione e un metodo novello per la ricostituzione 3D sono indispensabili al fine di avanzare i nostri protocolli alla clinica delle terapie basate sulle cellule.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ALX4_Goat antibody	Santacruz	sc-22066
Apo-transferrin	Sigma	T1147
BMP4	R&D	314-BP-010
BMP7	R&D	354-BP-010
Bovine serum albumin	Sigma	A8806
Calcium chloride	Nacalai tesque	067730-15
CDH11_Mouse antibody	Cell signaling	13577
Cell streching device	Strex	STB-140
Chemically defined lipid concentrate	Gibco	11905-031
CHIR99021	Axon	1386
COL1A1_Rabbit antibody	Abcam	ab34710
COL2A1_Mouse antibody	Thermo scientific	MS-235
Collagenase IV	Thermofisher	17104019
DLL1 APC-conjugated_Mouse antibody	R&D	FAB1818A	For FACS
DMEM	Sigma	D6046
DMEM/F12	Gibco	11320-082
DMH1	Tocris	4126
EN1_Rabbit antibody	Abcam	ab70993
Fetal bovine serum	Nichirei	171012
FGF2	Wako	060-04543
FGF8	Peprotech	100-25
Human dermal fibroblast	Cell applications	160-05a
Human tenocyte	Angio proteomie	cAP-0041
Insulin	Wako	090-06474
Iscove’s modified Dulbecco’s medium/Ham’s F12	Gibco	21056023
Knockout SR	Gibco	10828028
LDN193189	Axon	1509
Matrigel	BD bioscience	354230	Artificial extracellular matrix
MEOX1_Rabbit antibody	Abcam	ab75895
MHC_Rabbit antibody	Santacruz	sc-20641
MKX_Rabbit antibody	Atlas antibodies	A83377
Monothioglycerol	Sigma	M6145
mTeSR1	Stemcell tech	85850
Multi well-type silicon rubber chamber	Strex	STB-CH-4W
MYOD_Rabbit antibody	Abcam	ab133627
MYOG_Mouse antibody	Santacruz	sc-12732
NKX3.2_Rabbit antibody	Sigma	HPA027564
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody555	Invitrogen	A21432
Novex Donkey anti Goat IgG(H+L) secondary antibody647	Invitrogen	A21447
Novex Goat anti Mouse IgG(H+L) secondary antibody555	Invitrogen	A21422
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody555	Invitrogen	A21428
Novex Goat anti Rabbit IgG(H+L) secondary antibody647	Invitrogen	A21245
PARAXIS_Rabbit antibody	Santacruz	sc-98796
PAX1_Rabbit antibody	Abcam	ab95227
PAX9_Rabbit antibody	Gene tex	GTX104454
PBS	-	-
PDGFRa_Goat	R&D	AF307
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Primate ES cell medium	Reprocell	RCHEMD001
SAG	Calbiochem	566661
SB431542	Selleckchem	SEL-S1067-10
SCX_Rabbit antibody	Abcam	ab58655
TBX6_Goat antibody	R&D	AF4744
Tendon cell growth medium	Angio-proteomie	cAP-40	Tenocytes growth medium
TGFβ3	R&D	243-B3-200
Trypsin	Gibco	15090046