Средняя подготовка к культивированию микроорганизмов в строго анаэробных/аноксических условиях

Поскольку обязыванные анаэробные организмы не могут расти при воздействии кислорода, использование анаэробных методов культивирования является необходимым. Здесь мы демонстрируем простой и эффективный метод культивирования смешанной культуры, полученной из биогазового растения от подготовки средств массовой информации к газу и квантификации летучих жирных кислот.

Аннотация

В отличие от аэробных организмов, строго анаэробные микроорганизмы требуют отсутствия кислорода и, как правило, низкий потенциал редокса для инициирования роста. Поскольку кислород вездесущ в воздухе,сохранение O 2-свободных условий во время всех этапов выращивания является сложной задачей, но необходимым условием для анаэробного культивирования. Представленный здесь протокол демонстрирует успешное выращивание анаэробной смешанной культуры, полученной из биогазового растения простым и недорогим методом. Точное описание всего аноксического процесса культивирования дается в том числе подготовка средств массовой информации, заполнение культивирования фляг, добавки с индикатором Redox и сокращение агентов, чтобы обеспечить низкий потенциал Redox, а также обмен headspace держать средства массовой информации, свободные от кислорода. Кроме того, представлен подробный обзор асептически изолирующих газовых плотных сывороточных флягов (с использованием стерильных шприцев и игл) и подходящих условий инкубации. В настоящем протоколе далее рассматриваются газовые и жидкие отборы для последующего анализа состава газа и концентраций летучих жирных кислот с использованием газовой хроматографии (ГК) и высокопроизводительной жидкой хроматографии (ГПЛК), соответственно, и расчет урожайности биогаза и метана с учетом идеального газового закона.

Введение

На земле молекулярный кислород в заметных концентрациях доступен в областях, имеющих прямой контакт с атмосферой или в присутствии кислородных фототрофов. Среды, в которых отсутствует кислород, называются анаэробными. Тем не менее, преобразование энергии все еще возможно в анаэробных условиях через два различных метаболических процессов, брожения и анаэробного дыхания¹.

В то время как организмы, проходящие аэробное дыхание используют кислород в качестве терминального приема электронов, анаэробное дыхание требует альтернативных электронных приемов, таких как нитрат или сульфат^2. В так называемой «электронной башне» пары редокса организованы в соответствии с их потенциалом редокса, причем самые отрицательные расположены в верхней части (доноры электрона) и сильнейшие агенты окисления с положительным потенциалом редокса на дне (электронные приемы). Передача электронов между донорами и принимающими сторонами приводит к энергосбережению через так называемую дыхательную цепь, а электроны могут быть захвачены электронными приемотелями - чтобы остаться на картинке - на разных этажах башни. Тем самым, чем выше падение электронов через электронную башню, тем больше энергии может быть сохранено соответствующей реакцией. Таким образом, дыхание также возможно в анаэробных средах обитания, например, с redox пары в том числе No₃^-/NO₂^-, фумационная кислота / succinic кислоты, SO₃^2-/H₂S, S '/H₂S, Mn (IV) / Mn (II ), Fe (III)/Fe (II)²^,³. Во-первых, полученная энергия сохраняется в качестве мембранного потенциала, который впоследствии используется при фосфорилировании электронов для синтеза аденозин-трифосфата (АТФ) мембранно-связанным аТФ-синтазами. В отличие от аэробного дыхания, количество энергии, которое может быть сохранено анаэробным дыханием, может быть значительно уменьшено; однако, выход энергии большинств анаэробных дыханий все еще более высок сравненный к закваранжению,анаэробный путь консервации энергии в habitats нуждался кислороде и других принимать енота терминала 2.

Во время брожения богатые энергией органические субстраты деградируют до различных продуктов брожения, которые часто определяют название общего процесса, например, алкогольное брожение. В отличие от процессов дыхания, генерация АТФ во время брожения ограничивается фосфорилированием на уровне субстрата, во время которого фосфатная группа передается в аденозин-ди-фосфат (АДП) из богатого энергией фосфорилированного субстрата^2. Ферментающие микроорганизмы играют центральную роль в анаэробной деградации органических веществ, поскольку они являются ключевыми игроками в распаде субстрата. Первичные продукты брожения, как органические кислоты, спирты, CO₂, и H₂, впоследствии могут быть использованы вторичными ферментирующих микроорганизмов для производства уксусной кислоты, CO₂, и H₂. Примерами для ферментации продуктов являются молочная кислота, различные летучие жирные кислоты (форми-, уксусно-, пропирионические-, бутирик-, валерианол, 2,3-бутандиол, ацетон и этанол.

Культивирование микроорганизмов в строго анаэробных условиях требует совершенно иных методов и оборудования по сравнению с культивированием аэробных организмов. В то время как кислородоустойчивые организмы часто культивируются на агарных блюдах, так называемых поверхностных культурах, это - за некоторыми исключениями - вряд ли возможно для строго анаэробных микроорганизмов. Таким образом, обогащение культур строго анаэробных микроорганизмов в основном установлены в жидком носителе, применяя культурные сосуды, запечатанные газонепроницаемой септойкой, которые обеспечивают бескислородную атмосферу headspace^4,⁶^, ⁷.

В настоящем описании протокола будут предусмотрены надлежащие методы выращивания целевых микроорганизмов смешанной популяции, полученные из анаэробного биогазового растения. Изоляция и культивирование чистых культур является еще более сложной задачей, но не является частью этой работы.

Здесь мы показываем процедуру выращивания анаэробного микробного сообщества на основе исследования, касающегося образования фенилкислот при анаэробном переваривании белково-белковых субстратов⁸. Микробное сообщество состояло из представителей всех четырех фаз анаэробного пищеварения: гидролиз, ацидогенез, ацетогенез и метаногенез. Минеральная соляная среда, дополненная источником углерода, редокс-индикатором,раствором витамина и микроэлемента, и редуксовым агентом, была применена 9. Среда была изменена с соответствующими белковых фенилкислотных прекурсоров субстратов⁸.

протокол

1. Подготовка средних

Приготовьте раствор запаса индикатора redox (0,1 г раствора резазурина/100 мл aqueous раствора).
Приготовить витаминный раствор(таблица 1).
Подготовка решения микроэлемента(таблица 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок добавления имеет важное значение; пожалуйста, обратитесь к таблице 2 и соответствующим протоколам.
Подготовьте раствор для снижения запасов агента (60 г Na₂S/L aqueous раствор).
Взвесьте средние ингредиенты (минеральная соляная среда, таблица 3) в соответствующей колбе (например, 1 л лабораторной колбы винтовой крышки).
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальной установки может потребоваться добавление отдельного источника углерода.
Добавить полтомдистиллы воды(Таблица 3) и растворить ингредиенты.
Добавьте 1 мл раствора индикатора redox в соответствии с таблицей3.
Добавить витамин и микроэлемент раствор в соответствии с таблицей 3.
Отрегулируйте рН в соответствии со средними/требованиями организма в таблице3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет индикатора redox зависит от рН и может потребовать некоторого времени для настройки.
Довести до окончательного объема 1 л с дистиллированной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Витамин и микроэлементы решения также могут быть добавлены после автоклавирования путем асептикно добавив фильтр-стерилизованный аликот (разбавленные растворы, фильтр пор размером lt; 0.2 мкм) в ранее закрытые и autoclaved фляги сыворотки. Однако такой подход несет повышенный риск заражения.

2. Заполнение культиваемых колб

Тщательно очистить и высушить 120 мл сыворотки колбы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сывороточные колбы доступны в различных объемах (например, 20, 60, 120, 250 мл).
Тщательно чистая и сухая бутиловая резиновая септа.
Взвесьте дополнительные средние компоненты (например, субставки прекурсора фениловой кислоты) в культивационных флягах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные компоненты зависят от экспериментальной установки и гипотезы.
Заполните фляги сыворотки 50 мл среднего.

3. Сокращение/удаление кислорода в жидкой фазе

Приготовьте водяную ванну на 100 градусов цельсия.
Установите заполненные сывороточные колбы в водяной бане и инкубировать около 20-30 мин, чтобы уменьшить растворимость O₂ в жидкой фазе.
Промыть headspace немедленно с n₂ газа или в качестве альтернативы с другими газовыми или газовыми смесями, как N₂/CO₂.
ВНИМАНИЕ: Позаботьтесь о надлежащей вентиляции помещения.
Закройте фляги с бутиловой резиновой септой и зафиксировать алюминиевыми колпачками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Резиновая септа часто может лучше поместиться на шее колбы, добавив каплю воды / среднего при бурении его дюйма
Добавьте 0,1 мл редукционного агента (запасного раствора) к каждой колбе, заполненной 50 мл средней, чтобы еще больше уменьшить потенциал редокса (0,1 мл редоксиковый агент на 50 мл средней среды).
Автоклав в течение 20 мин при 121 градусах По Цельсию.
ВНИМАНИЕ: Автоклав, сертифицированный для стерилизации закрытых судов, должен быть использован. В противном случае, избыточное давление, полученное от повышения температуры может привести к сыворотке колбы взорваться.

4. Прививка среды

Приготовьте инокулум из анаэробного реактора.
1. Добавьте 400 мл дистиллированной воды в колбу и доведите ее до кипения.
2. Охладите его вниз (Злт; 30 градусов по Цельсию) в то время как постоянно промывки головного пространства с N₂.
3. Добавьте около 100 г шлама, полученного из анаэробного реактора.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерного контакта шлама с кислородом.
4. Запись точной массы добавленного шлама для точного определения разбавления.
5. Обмен ячись на голову колбы с N₂ и закройте его резиновой перегородкой.
6. Встряхните колбу в течение 30 минут при 120 об/мин.
Удалите 5 мл инокулума с помощью шприца и канюли и введите его в подготовленные сывороточные колбы, как описано в шаге 1-3.

5. Инкубация, отбор проб и анализ

Инкубировать привитые сывороточные фляги при температуре, подходящей для соответствующего эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура инкубации зависит от экспериментальной установки и используемого инокулума.
1. Слейте слив сверхдавление в результате повышения температуры с помощью шприца и канюли, когда жидкость в сывороточной колбе уравновешивают до температуры инкубации (около 15 - 30 мин, в зависимости от температуры инкубации).
  ВНИМАНИЕ: В зависимости от прикладного субстрата, его концентрации, температуры, времени инкубации, типа инокулума и концентрации, чрезмерное давление в колбах может возрасти до 2 барного давления и может привести к взрыву сыворотки. Поэтому мониторинг избыточного давления с помощью манометра и последующего слива избыточного давления канюлей является обязательным.
Оцените производство и состав биогаза во время инкубационного времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный период может длиться от нескольких дней до нескольких недель.
1. Рекордное текущее атмосферное давление.
2. Подготовьте манометр и оцените давление внутри колб, полученных от микробной активности.
3. Встряхните колбы.
4. Удалите 1 мл газа в области головного пространства с помощью шприца и канюли и измерьте H_2,O_2,CH₄и/или co₂ концентрации с помощью газовой хроматографии.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Для квалификации и количественной оценки H_2,O_2,CH₄и CO_2, был использован газовый хроматограф при меняющих температуру эксплуатации 160 градусов по Цельсию (колонка печи), 100 кВ (инжектор) и 180 градусов по Цельсию (детектор теплопроводности, TCD ). N₂ использовался в качестве переносица газа. Для получения подробной информации, обратитесь к предыдущим исследованиям¹⁰.
Мониторинг концентраций летучих жирных кислот (VFA) и фениловых кислот. Для анализа VFA и фениловой кислоты используйте систему HPLC, оснащенную УФ-детектором (на 220 нм), работающим с 5 мМ Н/2 SO₄ в качестве подвижной фазы. Для получения подробной информации метода и дополнительной информации о хранении образцов, пожалуйста, обратитесь к предыдущим исследованиям¹¹.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ VFA является образцовым для многих других физико-химических анализов или микроскопических оценок. Кроме того, с помощью описанной процедуры могут применяться молекулярно-биологические методы, нацеленные на обилие конкретных микроорганизмов и/или состава микробного сообщества в определенный момент эксперимента.
1. Удалите 1 мл жидкости со шприцем и канюлей.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть заморожены (-20 градусов) сразу после вывода и проанализированы в конце эксперимента¹¹.
2. Центрифуга на 15000-20000 х г и пройти через 0,2 мкм RC (регенерированная целлюлоза) фильтры.
3. Вводят 5-20 л л на систему HPLC и анализируйте на состав VFA и концентрацию фениловых кислот.
Слейте фляги в избыточное давление с помощью канюли.
ПРИМЕЧАНИЕ: После определения давления и состава газа, а также принимая любой необходимый образец, поместите колбу для выращивания обратно на соответствующую температуру и не слейте избыточное давление, прежде чем жидкость достигла температуры инкубации.
Рассчитайте производство биогаза и метана V_CH4N с учетом идеального газового закона с помощью Equation 1-3. Пожалуйста, также обратитесь к таблице 4.
Уравнение 1:
Whereby
Уравнение 2:
И
Уравнение 3:
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета общего объема производства биогаза, количество CH_4% и CH_4%X в уравнении 2 и 3 должен быть установлен до 100. НмЛ: нормализованный объем газа в стандартизированных условиях (0 кв.м, 1 атм), при котором объем молярового газа составляет 22,414 Нмл/моль.

Результаты

Культивирование колбы были заполнены средой в анаэробных условиях в соответствии с протоколом, описанным выше, проверены на соответствующий цвет(Рисунок 1), и используется в качестве миниатюрных биореакторов партии проведения анаэробного пищеварения. Они были изменены с субстратов потенциально вызывая образование фенилкислоты и инкубировали с использованием анаэробных ила реактора, как инокулум (Рисунок 2). Триптофан, тирозин и фенилаланин, а также сложный белково-прекурсорный экстракт мяса и казеин были применены в двух и трех различных концентрациях, соответственно. Меры контроля были подготовлены без дополнительных субстратных добавок. Различные концентрации субстрата, направленные на моделирование различных стадий перегрузки. Колбы были инкубированы при 37 градусах Цельсия (мезофильных) в течение 4 недель.

Производство и состав биогаза (H_2,CH_4,CO₂) регулярно отслеживались с помощью газовой хроматографии (GC TCD)¹⁰ и оценки давления в области головного пространства. На рисунке 3 показаны различия в кумулятивном производстве метана, полученных в виде переваривания прикладных субстратов в различных концентрациях в течение 4 недель анаэробной инкубации. Кроме того, метаногены были визуализированы путем облучения коэнзима F₄₂₀, электрон перевозчика в метаногенезе, демонстрируя сине-зеленую флуоресценцию с максимумом поглощения на 420 нм (Рисунок 4).

Параллельно с анализом газа образцы для измерений концентрации VFA и фенилкислоты через HPLC¹¹ были изъяты и заморожены до дальнейшей обработки. На рисунке 5 показан эффект различных стадий перегрузки, отраженный накоплением в сильно перегруженных образцах, илпредываемых для ацетата. На рисунке 6 показана динамика концентраций фенилаааата тацетата в инкубационный период.

figure-results-2258
Рисунок 1: Индикатор Редокса. Правильный потенциал редокса в культивировании колбы можно контролировать, добавив индикатор Redox. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-2715
Рисунок 2: Миниатюрные биореакторы партии. Миниатюрные биореакторы для выращивания 120 мл готовятся для экспериментов по анаэробному пищеварению. Колбы были заполнены средним и привитыми с разбавленным ила реактора. Реакторы были плотно запечатаны бутиловыми резиновыми пробками и алюминиевыми колпачками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-3348
Рисунок 3: Производство метана. Совокупное производство метана в течение 28 дней мезофильной инкубации из реакторов, отражающих различные условия перегрузки (низкий, средний, высокий). Конт: контроль; Трип: триптофан; Тир: тирозин; Phe: фенилаланин; ME: мясной экстракт; Cas: casein. Это модифицированная цифра, полученная из более раннего исследования⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4054
Рисунок 4: Флуоресцентирование метаногенов. Метаногены излучают синеватый свет, когда возбуждаются ультрафиолетовым светом. Здесь метаногены прикрепляются к растительным частицам (светло-зеленым). Образцы были взяты из серийного реактора, разбавлены для микроскопии, и немедленно проанализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-4679
Рисунок 5: Концентрация ацетата. Концентрация ацетата в течение 28 дней мезофильной инкубации в реакторах, отражающих различные условия перегрузки (низкие, средние, высокие). Конт: контроль; Трип: триптофан; Тир: тирозин; Phe: фенилаланин; ME: мясной экстракт; Cas: casein. Это модифицированная цифра, полученная из более раннего исследования⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5375
Рисунок 6: Концентрация фенилацетата. Концентрация фенилецептата в течение 28 дней мезофильной инкубации в реакторах, отражающих различные условия перегрузки (низкие, средние, высокие). Конт: контроль; Трип: триптофан; Тир: тирозин; Phe: фенилаланин; ME: мясной экстракт; Cas: casein. Это модифицированная цифра, полученная из более раннего исследования⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-6082
Рисунок 7: Реакция Раззурина. Синий цвет резазурина подвергается необратимому уменьшению ресоруфина (розового) и дальнейшему обратимому снижению бесцветного дигидроресоруфина по узарскому и др.^12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Цианокобаламин	0,050 г
4-аминобензойная кислота	0,050 г
D-биотин	0,010 г
Никотиновая кислота	0,100 г
Пиридоксина	0,250 г
D-пантотеновая кислота	0,025 г
Тиаминий хлорид HCl	0,18 г
Дистиллированная вода	1000 мл

Таблица 1: Витаминное решение.

25% (w/v) HCl	10,0 мл л.
FeCl₂ x 4 H₂O	1,50 г
NCl₂	0,070 г
MnCl₂ x 4 H₂O	0,100 г
H₃BO₃	0,006 г
CoCl₂ x 6 H₂O	0,190 г
CuCl₂ x 2 H₂O	0,002 г
NiCl₂ x 6 H₂O	0,024 г
Na₂MoO₄ x 2 H₂O	0,036 г
Дистиллированная вода	990,0 мл л.
Рекомендация по подготовке	Добавить HCl ирастворить FeCl 2, добавить 100 мл дистиллированной воды, растворить другие ингредиенты, и сделать до 1000 мл.

Таблица 2: Решение элемента трассировки.

Nacl	1,0 г
MgCl₂ x 6 H₂O	0,4 г
KH₂PO₄	0,2 г
Kcl	0,5 г
CaCl₂ x 2 H₂O	0,15 г
L-цистеин	0,5 г
Дрожжевой экстракт	1,0 г
Раствор resazurin	1 мл
Витаминное решение	1 мл
Решение элемента трассировки	1 мл
Дистиллированная вода	1000 мл
Ph	7.2

Таблица 3: Минимальная соляная среда.

Переменной	Единицы	Описание
t_{Y Y}	(д)	Сроки измерения
t_X	(д)	Сроки предыдущего измерения
р_М	(мбар)	Измерено избыточное давление при t_Y
р_А	(мбар)	Окружающее давление при t_Y
р_AX	(мбар)	Окружающее давление при t_X
р_S	(мбар)	Стандартное давление, 1013,25 мбар acc. DIN 1343
T_I	(K)	Температура инкубации
T_S	(K)	Стандартная температура, 273,15 К (соответствует 0"C) acc. DIN 1343
V_H	(мл)	Объем пространства headspace на t_Y
V_HX	(мл)	Объем пространства головы на t_X
CH_4%	(vol%)	Концентрация метана в соответствии с GC-измерением при t_Y
CH_4%X	(vol%)	Концентрация метана в соответствии с GC-измерением на t_X
V_CH4T	(Нмл)	Общее количество метана в бутылке сыворотки на t_Y
V_CH4R	(Нмл)	Остаточная сумма метана в головном пространстве на t_X
V_CH4N	(Нмл)	Недавно произведенный метан от t_Xк t_Y

Таблица 4: Описание переменных в уравнении 1 - 3.

Обсуждение

Наиболее важным и важным шагом в выращивании анаэробных микроорганизмов является обеспечение бескислородных условий в средствах выращивания и области головы колб. Индикатор, как resazurin может быть использован для косвенной проверки правильного анаэробного заполнения колбы. Resazurin является широко используемым красителем redox, как это недорогой, нетоксичный, и уже эффективны в низких дозах и короткие инкубационные раз ¹². При включении в средства массовой информации, синий цвет resazurin сначала проходит необратимые шаг сокращения resorufin, который розовый при нейтральных значениях рН. Эта первая реакция может произойти, когда средства массовой информации нагреваются ¹³. Впоследствии ресоруфин сводится к бесцветной дигидроресоруфин в обратимой вторичной реакции(рисунок 7)¹². Система resorufin/dihydroresorufin redox становится совершенно бесцветной при стандартном потенциале снижения окисления около E_h -110 мВ и становится розовым выше редокс-потенциала -51 mV ^13.

Для дальнейшего снижения потенциала редокса, например, для облегчения роста метаногенных микроорганизмов, которые, как известно, требуют менее -200 мВ^14,может быть добавлен раствор Na₂S. Кроме того, обычно используются цистеин-HCl, тиогликолна натрия или дитионита натрия. Однако, какой редуктор подходит для использования, зависит от соответствующей экспериментальной установки и может потребовать особого внимания. Например, тиогликолят натрия нуждается в активации температуры (например, путем автоматического вскрытия).

Хорошо сбалансированный микробный консорциум, состоящий из различных родов бактерий и археев, и эффективно работающий анаэробный каскад деградации могут быть дополнительно оценены путем определения состава газа в области культуры с помощью газа Хроматографии. При обработке соединений, как фенилкислоты, полученные из различных прекурсоров, оценка головного пространства является быстрый способ проверить процесс метаногенеза⁸. Концентрация CH₄ в области управления в конце инкубационного периода указывает на успешное использование прикладных питательных веществ и, таким образом, на минерализацию органического материала в анаэробных условиях. Теоретические производства метана и ожидаемые концентрации метана в процессе пищеварения могут быть определены ex ante в соответствии с уравнением Басвелла-Бойла после элементарного анализа субстрата или путем оценки содержания углеводы, белки и жиры в субстрате. Согласно VDI 4630 ^15,углеводы могут привести к теоретическому производству биогаза 750 л кг^-1 VSS (50% CH₄ и 50% CO 2), белков до 800 л^{кг -1} VSS (72% CH₄ и 28% CO_2),а жиры до 1390 л кг ^-1 VSS (60% CH₄ и 40% CO_2).

Кроме того, отслеживались образование и возможная последующая деградация ВФА и фениловых кислот. Процесс деградации можно оценить, проанализировав концентрации VFA (например, ацетат, пропионат) в разных точках времени. Накопление короткоцепочечных жирных кислот, таких как ацетат и/или пропионат, может указывать на нарушения в метаногенном составе сообщества и на общую перегрузку реактора. Однако хорошо сбалансированный каскад микробной деградации может даже справиться сочень высокой концентрацией VFA и ацетата 9. Кроме того, ацетат / пропионат соотношение может дополнительно предоставить информацию об общем состоянии реактора¹⁶. Однако существует много параметров, подходящих для мониторинга процессов, которые должны быть отобраны в соответствии с предлагаемыми экспериментальными гипотезами. В данном примере целевыми переменными были концентрации фениловой кислоты(рисунок 6).

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование финансировалось Австрийским научным фондом (FWF): номеры проектов P 29360 и P 29143. Публикация была поддержана PublikationsFonds der Universit't Innsbruck. Мы высоко ценим EIG.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
culture flasks (120 mL, N20)	Ochs, Germany	102046
buty rubber septa (N20)	Ochs, Germany	102049
aluminium caps (N20)	Ochs, Germany	102050
N2 gas	Messer, Austria		purity 5.0
syringes + cannulae	various
crimper	Ochs, Germany	102051
de-crimper	Ochs, Germany	102052
GC2010	Shimadzu
Shin-carbon GC column	Restek		chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2
HPLC Prominence	Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column	Phenomenex		chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.