Лазерная травма головного мозга в моторном кортексе крыс

Резюме

Протокол, представленный здесь показывает технику создания модели грызунов черепно-мозговой травмы. Описанный здесь метод использует лазерное облучение и нацелен на моторную кору.

Аннотация

Общий метод индуцирования инсульта в экспериментальных моделях грызунов включает в себя переходный (часто обозначаемый как MCAO-t) или постоянный (обозначенный как MCAO-p) окклюзия средней мозговой артерии (MCA) с помощью катетера. Однако этот общепринятый метод имеет некоторые ограничения, что ограничивает его широкое применение. Индукция инсульта с помощью этого метода часто характеризуется высокой изменчивостью локализации и размера ишемической области, периодическими случаями кровоизлияния и высокими показателями смертности. Кроме того, успешное завершение любой из переходных или постоянных процедур требует опыта и часто длится около 30 минут. В этом протоколе представлена техника лазерного облучения, которая может служить альтернативным методом для индуцирования и изучения черепно-мозговой травмы в моделях грызунов.

По сравнению с крысами в контрольных и MCAO групп, черепно-мозговая травма лазерной индукции показали снижение изменчивости температуры тела, объема инфаркта, отек мозга, внутричерепное кровоизлияние, и смертность. Кроме того, использование лазерной индуцированной травмы вызвало повреждение тканей головного мозга только в моторной коре, в отличие от экспериментов MCAO, где наблюдается разрушение как моторной коры, так и стриатальных тканей.

Результаты этого исследования показывают, что лазерное облучение может служить в качестве альтернативного и эффективного метода для индуцирования черепно-мозговой травмы в моторной коре. Метод также сокращает время завершения процедуры и не требует опытных обработчиков.

Введение

Во всем мире инсульт является второй по величине причиной смерти и третьей по счету причиной^{инвалидности 1.} Инсульт также приводит к тяжелой инвалидности, часто требующей дополнительной помощи со стороны медицинского персонала и родственников. Существует, следовательно, необходимо понять осложнений, связанных с расстройством и улучшить потенциал для более положительных результатов.

Использование моделей животных является первым шагом к пониманию заболеваний. Для обеспечения наилучших результатов исследований типичная модель будет включать простую технику, доступность, высокую воспроизводимость и минимальную изменчивость. Детерминанты в моделях ишемического инсульта включают объем отеков мозга, размер инфаркта, степень распада гемового барьера (BBB) и функциональные нарушения, обычно оцениваемые с помощью неврологического балла^{тяжести 2.}

Наиболее широко используемая методика индукции инсульта в моделях грызунов затмевает среднюю мозговую артерию (MCA) преходяще или постоянно^3. Этот метод производит модель инсульта похож на те, в организме человека: он имеет полутени, окружающие погладил области, является весьма воспроизводимой, и регулирует продолжительность ишемии и reperfusion⁴. Тем не менее, метод MCAO имеет некоторые осложнения. Техника склонна к внутричерепным кровоизлияниям и повреждению ипсилатеральной сетчатки с дисфункцией зрительной коры и общей гипертермией, что часто приводит к^{дополнительным исходам 5,,6,,7.} Другие ограничения включают высокие различия в индуцированном инсульте (в результате вероятного распространения ишемии на непреднамеренные регионы, такие как область внешней сонной артерии), недостаточное окклюзии MCA, и преждевременное реперфузии. Кроме того, крысы различных штаммов и размеров обладают различными инфарктными томами^8. В дополнение ко всем упомянутым недостаткам, модель MCAO не может вызвать небольшие изолированные инсульты в глубоких областях мозга, поскольку она технически ограничена с точки зрения требования минимального размера сосуда для катетеризации. Это делает потребность в альтернативной модели еще более критической. Другой метод, фототромбоз, обеспечивает возможную альтернативу процедурам MCAO, но не повышает эффективность^9. Этот метод цели инсульта со светом и предлагает некоторые улучшения на предыдущих моделях. Тем не менее, фототромбоз требует инвазивной краниотомии, которая связана со вторичными compications⁹.

В свете изложенных недостатков представленный здесь протокол предоставляет способную альтернативную лазерную технику для индуцирования черепно-мозговой травмы у грызунов. Механизм действия лазерной техники основан на фототермальных эффектах лазера на живые ткани, что приводит к поглощению световых лучей тканями организма и их превращению в тепло. Преимущества использования лазерной техники являются его безопасность и простота манипуляции. Способность лазера производить тепло, чтобы остановить кровотечение делает его очень важным в медицине, в то время как его способность усиливать различные лучи в данной точке встречи гарантирует, что лазеры избежать уничтожения здоровых тканей, что стоит на пути точки^{мишени 10}. Лазерный луч, используемый в этом протоколе, может проходить через низкую жидкую среду, такую как кость, не излучая ее энергию и/или не вызывая никаких разрушений. Как только он достигает высокой жидкой среды, такой как ткани мозга, он использует свою энергию, чтобы уничтожить ткани-мишени. Техника, таким образом, может вызвать черепно-мозговую травму только в соответствующей области мозга.

Техника, представленная здесь, показала огромную способность регулировать свои уровни облучения, производя выбранные вариации черепно-мозговой травмы, предназначенные с самого начала. В отличие от оригинального MCAO, который влияет как коры и стриатума, лазерная техника была в состоянии регулировать воздействие черепно-мозговой травмы, вызывая травмы только на предполагаемой моторной коры. В этом случае предусмотрен протокол о лазерной черепно-мозговой травме и резюме репрезентативных результатов процедуры, выполняемой на коре головного мозга крыс.

протокол

Следующая процедура была проведена в соответствии с Руководящими принципами использования экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были также одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Бен-Гуриона в Негеве.

1. Отбор и подготовка животных

1. Выберите 65 самцов крыс Sprague-Dawley весом от 300 до 350 г без какой-либо явной патологии для этой процедуры. Меньший размер создает технические трудности для процедуры MCAO.
2. Назначьте 3 крысы на клетку и дайте им адаптироваться в течение по крайней мере 3 дней.

2. Процедура MCAO

1. Выберите 25 крыс для MCAO позволяет 10-20% смертности, связанные с процедурой¹¹.
2. Выполните MCAO с использованием стандартной техники, как описано ранее подробно¹².

3. Лазерная индуцированная экспериментальная процедура черепно-мозговой травмы

1. Назначьте 20 крыс группе, отмеченной как лазерная группа, и 20 крыс другой контрольной группе (фиктивной).
2. Подвергайте крыс лазерной группы лазерному облучению на 50J X 10 точках следующим образом:
   1. Анестезия крысы со смесью 2% изофлюран в кислороде, что позволяет спонтанной вентиляции легких. Проверьте достаточную анестетичную глубину, ущипнув хвост щипами, чтобы увидеть отсутствие рефлекса вывода.
   2. Поддерживайте температуру тела крысы на уровне 37 градусов по Цельсию на протяжении всей экспериментальной процедуры с помощью регулируемой ректальной температуры нагревательной панели.
   3. Удалить местные волосы с бритвой и дезинфицировать с 70% алкоголя и 0,5% хлоргексидина глюконата. Повторите дезинфицирующее средство еще два раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер хирургического разреза должен быть примерно 3 см. Удалите волосы не менее 2 см вокруг области разреза.
   4. Поместите крысу на стереотаксис держатель головы в склонном положении и сделать 3 см разрез, чтобы отразить кожу головы боковой и подвергать области между Брегма и Lambda.
   5. Поддерживайте анестезию через носовой конус.
   6. Используйте лазер Neodymium-YAG (Nd-YAG) (пик длины волны 1064 нм) для управления 50J X 10 pointsточек, с 1 с продолжительностью импульса, к открытой области черепа над правым полушарием.
   7. Убедитесь, что лазерная генерирующая часть аппарата находится на расстоянии 2 мм от открытой области для производства лазерного луча. 50J X 10 точек было выбрано после тщательной оценки различных комбинаций энергии/поверхности. Эта комбинация эффективна и не вызывает разрушение костей черепа после введения менее чем за секунду^10.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2 мм - это расстояние между терминалом лазерного луча (от оптического кабеля, через который он проходит) и черепной костью. В случае использования фокусировки объектива расстояние должно быть рассчитано с учетом угла наклона объектива для фокусировки луча в нужной области повреждения. Обеспечить надлежащую безопасность при использовании лазерного устройства, включая соответствующую подготовку и защиту глаз.
   8. Снимите крысу с устройства и закройте кожу головы 3-0 шелковыми хирургическими швами.
   9. Прекратите анестезию и верните крысу в клетку для выздоровления. Администрирование 0,1 мл 0,25% bupivacaine локально, чтобы уменьшить послеоперационную боль сразу после операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна длиться менее 5 минут, если выполняется правильно.
3. Наблюдайте крысу для любых знаков дистресса во время восстановления столб-анестезии. До появления анестезии, дать 0.01mg/kg внутримышечного бупренорфина для послеоперационной анальгезии и продолжать с повторными дозами каждые 12 ч, по крайней мере 48 ч.
4. Субъект управления крыс в тех же условиях, не подвергая их лазеру.

4. Неврологический балл тяжести (NSS)

1. Оцените неврологическую тяжесть оценка 24 ч после лазерной индуцированной черепно-мозговой травмы с помощью 43-очковый^{балл 13}. Проверьте животных на неврологические дефициты, нарушения поведения, луч балансировки задачи, и рефлексы, назначая более высокие баллы для более тяжелой инвалидности, как ранее подробно¹³.

5. Манипуляции после травмы

1. После оценки NSS, усыплять крыс, подвергая их 20% кислорода и 80% CO2 (через вдохновение) и транскардиально perfuse крысы с гепаринизированным фосфат-буферизированным солевым раствором (PBS, 0.9% NaCl).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что CO_{2 поставляется} с заданной скоростью в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных. Этот шаг также может быть выполнен под 5% изофлюран анестезии.
2. Урожай мозгов и подготовиться к дальнейшему изучению, как описано в предыдущем^{протоколе 11}.
3. Оцените субарахноидальное кровоизлияние (САХ) путем визуального обследования всего мозга после его изоляции от черепа. При необходимости для этого можно использовать микроскоп или увеличительные очки.

6. Оценка черепно-мозговой травмы

1. Определение объема инфаркта мозга и отек мозга путем окрашивания ТТК
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2,3,5-Triphenyltetrazolium хлорид (TTC) окрашивание является удобной процедурой для обнаружения инфаркта^{мозга 11}.
   1. Раздел собранных мозгов на 6 корональных ломтиков, каждый толщиной 2 мм.
   2. Инкубировать набор ломтиков из каждого мозга в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию в 0,05% TTC.
   3. После окрашивания сканируйте ломтики с помощью оптического сканера с разрешением 1600 X 1600 dpi.
   4. Необленые области фиксированных ломтиков мозга определяются как infarcted¹².
   5. С помощью программного обеспечения для обработки изображений (например, freeware Image J)измеряется неописуемая область, ipsi- и контралатеральное полушария для каждого из 6 коронных ломтиков.
   6. Рассчитайте объем инфаркта в процентах от общего объема мозга:
      
   7. Рассчитайте отек мозга с помощью метода Каплана:
      
2. Определение степени разрыва гемового геммохатерного барьера (BBB)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените поломку BBB 24 ч после лазерной индуцированной черепно-мозговой травмы следующим образом:
   1. Администрирование 2% Эванс Синий смешанный с 4 мл / кг солевой раствор внутривенно крыс через канюленые хвостовой вены и позволяют раствору циркулировать в течение 1 ч.
   2. Euthanize крыс, подвергая их 20% кислорода и 80% CO₂ (через вдохновение) 24 ч после последнего NSS, как описано^{ранее 13}.
   3. Урожай внутрисосудисто локализованного красителя следующим образом:
      1. Откройте сундуки крыс хирургическими пинцетами и хирургическими ножницами.
      2. Perfuse животных с охлажденным 0,9% солевого раствора через левый желудочек с помощью 110 мм рт. ст. до получения бесцветной перфузионной жидкости из правого атриума.
   4. Урожай мозга и нарезать их rostrocaudally на 2 мм ломтиками.
   5. Отделить левые ломтики мозга от правой части для оценки раненых и не травмированных полушарий отдельно.
   6. Взвешивать, гомогенизировать с помощью раствора и пестика, а затем инкубировать ткани мозга в 50% трихлороацевой кислоты в течение 24 ч.
   7. Центрифуга гомогенизированных ломтиков мозга на 10000 и г в течение 20 мин.
   8. Смешайте 1 мл супернатанта из центрифугированного мозга с 1,5 мл этанола 96% при 1:3 и оцените разрыв гемового барьера с помощью детектора флуоресценции на длине волны возбуждения 620 нм (10 нм пропускной способности) и 680 Нм эмиссионной длины волны (10 нм пропускной способности).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе группы крыс проходят тот же протокол для определения BBB пробоя.

Результаты

Ни в контрольных, ни в экспериментальных группах (таблица1)не было зарегистрировано ни одного случая смерти или SAH. Уровень смертности в группе MCAO составил 20%.

Относительные изменения температуры тела у крыс обеих групп также были похожи, несмотря на разницу в изм...

Обсуждение

Справедливо предположить, что лазерная техника является минимально инвазивной, учитывая, что никаких смертей или SAH не произошло в лазерной группе. Основной причиной смерти и SAH является повреждение кровеносных сосудов, что приводит к повышению внутричерепного давления (ICP), как показа?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	SIGMA - ALDRICH	298-96-4
50% trichloroacetic acid	SIGMA - ALDRICH	76-03-9
Brain & Tissue Matrices	SIGMA - ALDRICH	15013
Cannula Venflon 22 G	KD-FIX	1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P	SIGMA - ALDRICH	Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances	SIGMA - ALDRICH	HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale	SIGMA - ALDRICH	Rs 4,000
Dissecting scissors	SIGMA - ALDRICH	Z265969
Eppendorf pipette	SIGMA - ALDRICH	Z683884
Eppendorf Tube	SIGMA - ALDRICH	EP0030119460
Ethanol 96 %	ROMICAL		Flammable Liquid
Evans Blue 2%	SIGMA - ALDRICH	314-13-6
Fluorescence detector	Tecan, Männedorf Switzerland	model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer	Heatingpad-1	Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff	ABN	IC-500
Isofluran, USP 100%	Piramamal Critical Care, Inc	NDC 66794-017
Multiset	TEVA MEDICAL	998702
Olympus BX 40 microscope	Olympus
Optical scanner	Canon	Cano Scan 4200F
Petri dishes	SIGMA - ALDRICH	P5606
Scalpel blades 11	SIGMA - ALDRICH	S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine	Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder	KOPF	900LS
Sterile Syringe 2 ml	Braun	4606027V
Syringe-needle 27 G	Braun	305620