Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем, как использовать новый инструмент для анализа отслеживания наночастиц для оценки распределения по размеру и общей концентрации частиц внеклеточных везикул, выделенных из перигонадной жировой ткани мыши и плазмы человека.

Аннотация

Физиологические и патофизиологические роли внеклеточных везикул (EV) становятся все более признанными, что делает область EV быстро развивающейся областью исследований. Существует множество различных методов изоляции электромобилей, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, которые влияют на выход и чистоту электромобилей. Таким образом, характеристика подготовки EV, изолированной от заданного источника выбранным методом, важна для интерпретации последующих результатов и сравнения результатов в разных лабораториях. Существуют различные методы определения размера и количества EV, которые могут быть изменены болезненными состояниями или в ответ на внешние условия. Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является одной из выдающихся технологий, используемых для высокопроизводительного анализа отдельных электромобилей. Здесь мы представляем подробный протокол количественной оценки и определения размера EV, выделенных из перигонадной жировой ткани мыши и плазмы человека, с использованием прорывной технологии для NTA, представляющей основные достижения в этой области. Результаты показывают, что этот метод может предоставлять воспроизводимые и достоверные данные об общей концентрации частиц и распределении по размеру для электромобилей, выделенных из разных источников с использованием различных методов, что подтверждается просвечиваюрной электронной микроскопией. Адаптация этого инструмента для NTA позволит рассмотреть необходимость стандартизации методов NTA для повышения строгости и воспроизводимости в исследованиях EV.

Введение

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой небольшие (0,03-2 мкм) связанные с мембраной везикулы, секретируемые почти всеми типами клеток1. Их часто называют «экзосомами», «микровезикулами» или «апоптотическими телами» в зависимости от их механизма высвобождения и размера2. Хотя первоначально считалось, что электромобили были просто средством устранения отходов из клетки для поддержания гомеостаза3,теперь мы знаем, что они также могут участвовать в межклеточной коммуникации посредством переноса молекулярного материала, включая ДНК, РНК (мРНК, микроРНК), липиды и белки4,<....

протокол

Вся работа с этими образцами проводилась в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию и Совета по институциональному обзору. Схематический обзор метода NTA показан на рисунке 2.

figure-protocol-359
Рисунок 2:Обзор метода NTA с использованием прибора слежения за частицами. Образец подготавливается и вставляется в инструмент. Программное обеспечение NTA открывается, па....

Результаты

Перед этой демонстрацией калибровка прибора была сначала протестирована для обеспечения достоверности полученных данных путем измерения распределения по размерам стандартов полистирольных шариков. Мы протестировали распределение размеров бусин 100 нм и 400 нм с использованием параме.......

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем протокол для NTA электромобилей для измерения распределения по размерам широкого диапазона размеров частиц одновременно и измерения общей концентрации EV в полидисперсном образце. В этом исследовании перигонадная жировая ткань мыши и плазма человека были исполь.......

Раскрытие информации

Все авторы заявили, что конфликта интересов нет.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Мы благодарим Джеффри Бодикомба, доктора философии HORIBA Instruments Incorporated, за его помощь в калибровке прибора.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1X dPBSVWR02-0119-1000To dilute samples
100 nm bead standardThermo Scientific3100ATo test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standardThermo Scientific3400ATo test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter UnitAmiconUFC901024To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mLQiagen19201For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air dusterDustOffDPSJB-12To clean cuvettes
Cuvette insertHORIBA Scientific-Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jigHORIBA Scientific-To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized waterVWR02-0201-1000To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cablesDell-Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)Millipore Sigma-To clean cuvettes
ExoQuick ULTRASystem BiosciencesEQULTRA-20A-1For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lidsThermo ScientificB780020To clean cuvettes
"Hook" toolExcelta-Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber clothTexwipeTX629To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mLEppendorf22363344For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir barSp SciencewareF37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with capAgilent TechnologiesAG1000-0544Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000HORIBA Scientific-Nanoparticle tracking instrument

Ссылки

  1. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
  2. Hessvik, N. P., Llorente, A.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

169EVMVNTA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены