Исследование развития дендритных клеток с помощью короткого шпильки РНК-опосредованного нокдауна гена в кроветворном стволе и клеточной линии-предшественника in vitro

Резюме

Здесь мы предоставляем протокол для скрининга потенциальных факторов транскрипции, участвующих в развитии дендритных клеток (DC), с использованием лентивирусной трансдукции шРНК для получения стабильных нокдаун клеточных линий для дифференцировки dc in vitro .

Аннотация

Дендритные клетки (ДК) являются важными антигенпрезентирующими клетками, которые связывают врожденные и адаптивные иммунные реакции. ДК неоднородны и могут быть разделены на обычные ДК (кДК) и плазмоцитоидные ДК (пДК). cDCs специализируется на представлении антигенов и активации наивных Т-клеток. С другой стороны, pDC могут производить большое количество интерферонов типа I (IFN-I) во время вирусной инфекции. Спецификация ДК происходит на ранней стадии предшественников ДК в костном мозге (БМ) и определяется сетью факторов транскрипции (ТФ). Например, кДК высоко экспрессируют ID2, в то время как pDC высоко экспрессируют E2-2. Поскольку выявляется все больше и больше подмножеств РС, растет интерес к пониманию конкретных ТФ, контролирующих разработку ЦОД. Здесь мы устанавливаем метод скрининга ТФ, критически важных для дифференцировки ДК in vitro , путем доставки лентивируса, несущего короткую шпильку РНК (шРНК), в увековеченную линию гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (iHSPC). После селекции и дифференцировки in vitro с помощью проточной цитометрии анализируются потенциал cDC и pDC стабильных нокдаун клеточных линий. Этот подход обеспечивает платформу для идентификации генов, потенциально управляющих судьбами DC от прародителей in vitro.

Введение

РС являются ключевыми регуляторами врожденного и адаптивного ^{иммунитета1}. РС в основном классифицируются на две функционально различные популяции, а именно pDC и cDC. Кроме того, кДК включают два подмножества, а именно кДК типа I и типа II или cDC1 и cDC2, ^{соответственно2}. pDCs, экспрессирующие BST2, Siglec-H и промежуточные уровни CD11c у ^{мышей3,4}, являются клетками, которые могут секретировать большое количество IFN-I во время воспаления и вирусной ^{инфекции5}. Благодаря своей надежной способности производить IFN-I, они также подозреваются....

протокол

Обращение с лентивирусом осуществляется в соответствии с правилами Департамента гигиены и безопасности окружающей среды Медицинского колледжа Национального университета Тайваня.

1. Подготовка увековеченных гемопоэтических стволовых и клеточных линий-предшественников (iHSPC)

1. Поддерживать клеточную линию iHSPC в полной среде RPMI 1640, содержащей 100 нг/мл FL и 1 мкМ β-эстрадиола.
2. Проходят клетки в соотношении 1:10 каждые 3 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте полную среду RPMI 1640, добавив 10% фетальную бычью сыворотку (FBS), 5 x ^10-5 М β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина. Рекомбинантный мышиный FL также коммерч....

Результаты

Показана карта лентивирусного вектора pLKO.1-Puro (рисунок 1). После доставки лентивируса, экспрессирующего шРНК против LacZ (нецелевой контроль), Tcf4 и Id2 в iHSPC, эффективность нокдауна, подтвержденная RT-qPCR, показала, что экспрессия Tcf4 была снижена в shTcf4 iHSPC .......

Обсуждение

Векторы шРНК на основе лентивируса часто используются для глушения генов путем вирусной трансдукции в клетки и обеспечивают стабильную интеграцию в геном хозяина. Тем не менее, необходимо учитывать различную эффективность трансдукции в разных типах клеток, и для преодоления этой про?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody	Biolegend	117324	(Clone: N418)
FITC anti-mouse/human CD11b Antibody	Biolegend	101206	(Clone: M1/70)
PE anti-mouse/human B220 Antibody	Biolegend	103208	(Clone: RA3-6B2)
Cell culture
1.5 mL Micro tube	ExtraGene	TUBE-170-C
12-well tissue culture-treated plate	Falcon	353043
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 medium	gibco	11875-085
Reagent
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-mercaptoethanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
FACS buffer	home-made		Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3
Flt3 ligand (FL)	home-made
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromycin	Invivogen	ant-pr-1
TRIsure	BIOLINE	BIO-38032
shRNA (Taregt sequence/clone ID)	Company
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	The RNAi Consortium (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	The RNAi Consortium (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	The RNAi Consortium (TRC)