Studio dello sviluppo delle cellule dendritiche mediante knockdown genico mediato da RNA a forcina corta in una linea cellulare ematopoietica e progenitrice in vitro

Riepilogo

Qui forniamo un protocollo per lo screening di potenziali fattori di trascrizione coinvolti nello sviluppo di cellule dendritiche (DC) utilizzando la trasduzione lentivirale di shRNA per ottenere linee cellulari di knockdown stabili per la differenziazione DC in vitro .

Abstract

Le cellule dendritiche (DC) sono importanti cellule che presentano l'antigene che collegano le risposte immunitarie innate e adattative. I DC sono eterogenei e possono essere suddivisi in DC convenzionali (cDC) e DC plasmacitoidi (pDC). cDCs è specializzata nella presentazione di antigeni e attivare cellule T naïve. D'altra parte, i pDC possono produrre grandi quantità di interferoni di tipo I (IFN-I) durante l'infezione virale. La specifica delle DC si verifica in una fase iniziale dei progenitori DC nel midollo osseo (BM) ed è definita da una rete di fattori di trascrizione (TF). Ad esempio, i cDC esprimono altamente ID2, mentre i pDC esprimono altamente E2-2. Poiché vengono identificati sempre più sottoinsiemi di DC, c'è un crescente interesse per la comprensione di specifici TF che controllano lo sviluppo DC. Qui, stabiliamo un metodo per lo screening dei TF critici per la differenziazione delle DC in vitro consegnando lentivirus che trasporta RNA a forcina corta (shRNA) in una linea immortalizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (iHSPC). Dopo la selezione e la differenziazione in vitro , il potenziale cDC e pDC delle linee cellulari stabili di knockdown viene analizzato mediante citometria a flusso. Questo approccio fornisce una piattaforma per identificare i geni che potenzialmente governano i destini della DC dai progenitori in vitro.

Introduzione

I DC sono regolatori chiave dell'immunità innata e ^adattativa1. I DC sono principalmente classificati in due popolazioni funzionalmente distinte, vale a dire pDC e cDC. Inoltre, i cDC comprendono due sottoinsiemi, vale a dire, rispettivamente, cDC di tipo I e di tipo II o cDC1 e ^cDC22. Le pDC, che esprimono BST2, Siglec-H e livelli intermedi di CD11c nei ^topi3,4, sono le cellule che possono secernere grandi quantità di IFN-I durante l'infiammazione e l'infezione ^virale5. Grazie alla loro robusta capacità di produrre IFN-I, si sospetta anche che svolgano un ruolo chiave nella progressione delle malattie autoimmuni, tra cui il lupus eritematoso sistemico (LES)⁶. I cDC1, definiti dall'espressione superficiale di XCR1, CD8a, CLEC9A e CD103 nei ^topi7, sono specializzati nell'attivazione e polarizzazione delle cellule T CD8⁺ citotossiche (CTL) attraverso la presentazione incrociata dell'antigene, avviando così l'immunità di tipo I in risposta a patogeni intracellulari e ^cancro8,9. D'altra parte, i cDC2, che esprimono CD11b e CD172α (noto anche come Sirpα) sia nell'uomo che nei topi, possono attivare le cellule T CD4 ⁺ e promuovere la risposta immunitaria di tipo II contro allergeni e ^parassiti10, oltre a modulare l'immunità di tipo III a seguito di batteri extracellulari e riconoscimento del microbiota11,12.

La diversificazione delle DC è determinata da un gruppo di TF da cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) nel BM. E2-2 (codificato da Tcf4) è un regolatore principale per la differenziazione e la funzione dei ^pDC13,14. Al contrario, l'inibitore del legame del DNA 2 (ID2) guida la specifica cDC e inibisce lo sviluppo di pDC bloccando l'attività della proteina ^E15. Inoltre, lo sviluppo di cDC1 richiede IRF8 e BATF3, mentre la differenziazione di cDC2 dipende fortemente da ^IRF416. Lavori recenti hanno esplorato l'eterogeneità dei ^pDC17 e dei cDC e la loro regolazione ^{trascrizionale18}. A causa della complessità della rete DC, vi è una necessità insoddisfatta di stabilire una piattaforma per identificare altri TF che controllano lo sviluppo e la funzionalità dei DC.

Qui, abbiamo usato un iHSPC che è stato generato esprimendo la traslocazione nucleare regolata dagli estrogeni di Hoxb8 nelle cellule BM (note anche come cellule Hoxb8-FL)¹⁹. Le iHSPC possono proliferare e rimanere in uno stadio indifferenziato in presenza di β-estradiolo e ligando Flt3 (FL), mentre iniziano a differenziarsi in diversi tipi di DC in presenza di FL al momento del ritiro di β-estradiolo19. Sulla base di questa caratteristica, possiamo abbattere i geni di interesse nella fase progenitrice, seguita dall'esame dell'effetto sulla differenziazione in vitro di pDC e cDC. Pertanto, questo metodo è un potente strumento per scoprire i geni che regolano lo sviluppo e la funzione dei DC.

Protocollo

La gestione del lentivirus viene eseguita secondo il regolamento del Dipartimento di salute e sicurezza ambientale del National Taiwan University College of Medicine.

1. Preparazione di linee cellulari staminali e progenitrici ematopoietiche immortalizzate (iHSPC)

1. Mantenere la linea cellulare iHSPC in un mezzo RPMI 1640 completo contenente 100 ng/mL FL e 1 μM β-estradiolo.
2. Passare le cellule ad un rapporto di 1:10 ogni 3 giorni.
   NOTA: Rendere completo RPMI 1640 medio integrando con 10% di siero bovino fetale (FBS), 5 x ^10-5 M β-mercaptoetanolo e 10 μg / mL di gentamicina. FL murino ricombinante è anche disponibile in commercio.

2. Trasduzione lentivirale

1. Piastra iHSPC ad una densità di 1 x ¹⁰⁵ celle/pozzetto in piastre a 12 pozzetti in 1 mL di mezzo completo contenente 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiolo e 8 μg/mL di polibrene.
   NOTA: La concentrazione di polybrene dipende dai tipi di cellule ed è solitamente compresa tra 4-8 μg/mL.
2. Aggiungere il lentivirus portatore di shRNA in ogni pozzetto ad una molteplicità di infezione (MOI) di 100.
   NOTA: Il vettore lentivirale è pLKO.1-Puro con un marcatore di selezione della puromicina (Figura 1). Le sequenze target di shRNA contro LacZ, Tcf4 e Id2, rispettivamente, sono elencate nella Tabella dei materiali. Il MOI è definito dal numero di virioni che vengono aggiunti per cellula durante l'infezione.
   
3. Ruotare le piastre a 1.100 x g per 90 minuti a 37 °C.
   NOTA: l'infezione da spin viene effettuata utilizzando un rotore a benna oscillante.
4. Incubare la piastra contenente cellule infette per una notte a 37 °C in un'incubatrice.
   NOTA: se le cellule sono sensibili al polibrene, aggiornare le cellule con il mezzo completo senza polibrene dopo l'infezione da spin.
5. Aggiornare le cellule con mezzo completo contenente 100 ng/mL FL e 1 μM β-estradiolo 24 ore dopo l'infezione.
6. Aggiungere 6 μg/mL di puromicina al mezzo per selezionare le cellule infette dopo ulteriori 24 ore.
   NOTA: Il vettore lentivirale trasdotto di solito richiede 48 ore per esprimere i geni, incluso il gene resistente alla puromicina. Assicurarsi che la concentrazione di puromicina sia ottimizzata per ogni linea cellulare.
7. Aggiornare il mezzo di selezione contenente 100 ng / mL FL, 1 μM β-estradiolo e 6 μg / mL puromicina ogni 3 giorni e mantenere le cellule per almeno una settimana per espandere le cellule iHSPC trasdotte stabilmente.
   NOTA: La selezione di puromicina di solito ha effetto 48 ore dopo e il periodo di selezione dipende dai tipi di cellule.

3. Misurazione dell'efficienza di abbattimento mediante trascrizione inversa e REAL-TIME PCR (RT-PCR)

1. Estrarre l'RNA totale da 1 x ¹⁰⁷ shLacZ, shTcf4 e shId2 cellule iHSPC stabili di knockdown utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA commerciale e precipitare l'RNA dallo strato acquoso con isopropanolo, seguito dal lavaggio del precipitato di RNA con etanolo al 75%.
2. Sciogliere l'RNA (~ 5 μg) con 5 μL di _H2O trattato con DEPC e regolare la concentrazione a 1 μg/μL.
3. Prendere 1-3 μg di RNA, mescolare con _H2O trattato con DEPC per un volume finale di 17,4 μL, aggiungere 1 μL di 1 unità/μL di DNasi I priva di RNasi e incubare per 20 minuti a 37 °C.
   NOTA: Questo passaggio consiste nel digerire il DNA genomico nei campioni di RNA.
4. Aggiungere 1 μL di 20 mM EDTA ai campioni di RNA, incubare a 65 °C per 10 minuti per inattivare la DNasi I e mettere immediatamente i campioni di RNA a 4 °C.
5. Aggiungere 11,6 μL della miscela di reazione contenente 1 μL di primer oligo (dT) (45 μM), 6 μL di 5x tampone del 1^° filamento, 3 μL di dNTP (2 mM), 0,6 μL di inibitore della RNasi (50 Unità/μL) e 1 μL di trascrittasi inversa (200 Unità/μL) ai campioni di RNA e incubare a 40 °C per 1 ora.
6. Arrestare la reazione riscaldando a 70 °C per 10 minuti e diluire la miscela di reazione con 30 μL di _H2O.
7. Prendi 2 μL della miscela di reazione RT diluita come modello di DNA e la PCR la amplifica usando primer contro Tcf4 o Id2 (vedi Tabella 1 per le condizioni del termociclatore).
   NOTA: le sequenze di primer sono incluse nella Tabella dei materiali.

4. Differenziazione in vitro delle linee cellulari iHSPC a knockdown stabile

1. Mantenere stabile il singolo knockdown di LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) o Id2 (shId2) in iHSPC in mezzo completo contenente 100 ng/ mL di FL e 1 μM β-estradiolo.
2. Raccogliere gli iHSPC indifferenziati shLacZ, shTcf4 e shId2 in un tubo da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 500 x g per pellettare le celle.
3. Scartare il surnatante e aggiungere 10 ml di PBS per lavare le cellule. Ripetere questo passaggio due volte.
4. Risospesciare e seminare le cellule iHSPC ad una densità di 2 x ¹⁰⁵ cellule/mL in una piastra a 12 pozzetti in 1 mL di mezzo completo contenente solo 100 ng/mL FL.
5. Aggiungere 1 mL di mezzo fresco completo contenente 100 ng/mL FL tre giorni dopo.
6. Analizzare le cellule differenziate (shLacZ, shTcf4 e shId2 iHSPC) mediante citometria a flusso due giorni dopo.

5. Analisi citometrica a flusso delle DC differenziate

1. Raccogliere le cellule in tubi da 1,5 ml tubando le celle su e giù 2-3 volte nella piastra e centrifugare per 5 minuti a 500 x g a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: i DC differenziati in vitro si attaccheranno leggermente alle piastre. Il pipettaggio delicato aiuterà a recuperare i DC dalle piastre.
2. Scartare il surnatante e risospese le cellule in 50 μL di tampone FACS. Quindi, aggiungere 50 μL di surnatante ibridoma anti-CD16/32 e incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio.
   NOTA: L'anticorpo bloccante Fc impedisce il legame non specifico degli anticorpi ai recettori Fc che si esprimono su alcune cellule mieloidi e cellule B ed è disponibile in commercio attraverso vari fornitori.
3. Aggiungere anticorpi coniugati con colorante fluorescente (0,04 μg per ciascun anticorpo) direttamente alle cellule e incubare per 15 minuti sul ghiaccio al buio. Gli anticorpi utilizzati sono APC/cy7 anti-mouse CD11c, FITC anti-mouse CD11b e PE anti-mouse B220.
   NOTA: i pDC sono definiti come CD11c⁺CD11b-B220⁺ e i cDC sono definiti come CD11c⁺CD11b⁺B220^-.
4. Lavare le celle con 1 mL di tampone FACS e centrifugare per 5 min a 500 x g a RT.
5. Risospendare le cellule in 100 μL di tampone FACS e analizzarle mediante citometria a flusso.

Risultati

Viene mostrata la mappa del vettore lentivirale pLKO.1-Puro (Figura 1). Dopo la somministrazione di lentivirus che esprimono shRNA contro LacZ (un controllo non mirato), Tcf4 e Id2 in iHSPC, l'efficienza di knockdown confermata da RT-qPCR ha rivelato che l'espressione di Tcf4 era ridotta nelle iHSPC shTcf4, rispetto alle iHSPC shLacZ (Figura 2A). D'altra parte, la diminuzione dell'espressione di Id2 ...

Discussione

I vettori shRNA basati su lentivirus sono spesso utilizzati per il silenziamento genico mediante trasduzione virale nelle cellule e consentono un'integrazione stabile nel genoma dell'ospite. Tuttavia, è necessario considerare varie efficienza di trasduzione in diversi tipi di cellule e sono stati adottati numerosi approcci per superare questo problema.

Polybrene è un polimero policanico in grado di neutralizzare le cariche sulla membrana cellulare, migliorando così il legame del virione al...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies
APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody	Biolegend	117324	(Clone: N418)
FITC anti-mouse/human CD11b Antibody	Biolegend	101206	(Clone: M1/70)
PE anti-mouse/human B220 Antibody	Biolegend	103208	(Clone: RA3-6B2)
Cell culture
1.5 mL Micro tube	ExtraGene	TUBE-170-C
12-well tissue culture-treated plate	Falcon	353043
Fetal bovine serum (FBS)	Corning	35-010-CV
RPMI 1640 medium	gibco	11875-085
Reagent
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-mercaptoethanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
FACS buffer	home-made		Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3
Flt3 ligand (FL)	home-made
Polybrene	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromycin	Invivogen	ant-pr-1
TRIsure	BIOLINE	BIO-38032
shRNA (Taregt sequence/clone ID)	Company
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	The RNAi Consortium (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	The RNAi Consortium (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	The RNAi Consortium (TRC)