JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол обеспечивает оптимизированный рабочий процесс для создания и тестирования химических антигенных рецепторов регуляторных Т-клеток человека (CAR Tregs).

Аннотация

Терапия Т-клетками с помощью химерных антигенных рецепторов (CAR) изменила подход к лечению рака, что привело к рекордным показателям ремиссии при ранее неизлечимых гематологических опухолях. Эти успехи вызвали интерес к адаптации платформы CAR к небольшому, но ключевому подмножеству CD4+ Т-клеток, в первую очередь ответственных за регуляцию и ингибирование иммунного ответа, регуляторных Т-клеток (Tregs). Способность перенаправлять иммуносупрессивную активность Tregs на любую внеклеточную мишень имеет огромное значение для создания клеточной терапии аутоиммунных заболеваний, отторжения трансплантата органов и реакции «трансплантат против хозяина». В этой статье мы подробно описываем методологии для добросовестного выделения Treg из периферической крови человека, генетической модификации человеческих Tregs с использованием лентивируса или CRISPR/Cas9-подобного ввода с использованием аденоассоциированного вируса, опосредованного гомологичной направленной репарацией (HDR) матрицы, а также ex vivo экспансии стабильных человеческих CAR Tregs. Наконец, мы описываем оценку фенотипической стабильности CAR Treg человека и супрессивной функции in vitro , что дает представление о том, как CAR Treg человека будут вести себя в доклинических и клинических приложениях.

Введение

Терапия Т-клетками с использованием химерных антигенных рецепторов (CAR) произвела революцию в лечении гематологических злокачественных новообразований, достигнув удивительно высоких показателей ремиссии при ранее неизлечимых видах рака. Обнадеживающие первые результаты использования CAR-Т-клеток для лечения глиобластомы 3,4,5 подчеркивают универсальность технологии CAR и будущий потенциал для борьбы с широким спектром злокачественных новообразований. По мере того, как в этой области исследуются дальнейшие применения CAR, регуляторные Т-клетки (Tregs) стали многообещающим типом клеток. Tregs играют решающую роль в поддержании иммунного гомеостаза и регуляции иммунных реакций с помощью нескольких механизмов, включая секвестрацию IL-2, секрецию иммуносупрессивных цитокинов и модуляцию антигенпрезентирующих клеток 6,7.

С помощью технологии CAR Tregs можно использовать для лечения отторжения трансплантата органов, аутоиммунных заболеваний и воспалительных расстройств, таких как аллергия и астма. CAR-Tregs может привести к значительному улучшению результатов лечения пациентов и качества жизни за счет сокращения использования иммуносупрессивных препаратов, которые подавляют иммунную систему в целом и связаны с вредными побочными эффектами10,11. Доклинические модели показали многообещающие результаты в переводе технологии CAR в Tregs, с успешным применением при таких заболеваниях, как диабет 1 типа, рассеянный склероз, реакция «трансплантат против хозяина» и воспалительные заболевания кишечника 9,12,13,14,15. В настоящее время в клинике исследуются CAR Tregs для предотвращения отторжения трансплантата солидных органов16.

В данной статье представлена подробная методика получения химерных антигенных рецепторов регуляторных Т-клеток человека (CAR Tregs). Этот протокол включает в себя выделение Tregs из периферической крови человека и их генетическую модификацию с использованием таких методов, как лентивирусная трансдукция и точное вбивание генов с помощью редактирования генов CRISPR/Cas9 и аденоассоциированных вирусных векторов (AAV). Мы также описываем оценку фенотипической стабильности и супрессивной функции этих сконструированных Tregs, которые являются решающими шагами для подтверждения их терапевтического потенциала 17,18,19. Такой подход оптимизирует разработку и раннее тестирование терапий CAR T-клеток, которые обладают потенциалом для расширения преобразующего воздействия терапии CAR T-клетками на регулирование иммунной системы. Делясь нашей методологией, мы надеемся вдохновить на дальнейшие исследования и инновации в растущем пространстве терапии CAR Treg 9,20.

протокол

1. Изоляция Treg человека

  1. Переработка лейкопака
    1. Переложите содержимое лейкопака в коническую пробирку объемом 50 мл. Добавьте равный объем фосфатно-солевого буфера (DPBS) Дульбекко + 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS), аккуратно перемешав с помощью пипетки.
    2. Отжим при 300 × г в течение 10 мин при комнатной температуре (RT). Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Восстановите клеточную гранулу в 2 мл DPBS + 2% FBS. Добавьте 8 мл раствора хлорида аммония пипеткой в клеточную суспензию в соотношении 4:1, перемешайте путем легкой инверсии и дайте лизису оставшихся эритроцитов на льду в течение 15 минут.
    3. Вращайте при 300 × г в течение 10 минут в RT. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость. Добавьте 30 мл DPBS + 2% FBS для промывания клеток. При выключенном тормозе отжимайте промытые клетки при 150 × г в течение 10 мин при RT. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 30 мл DPBS + 2% FBS.
    4. Подсчитайте теперь выделенные мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) с трипановым синим в соотношении 1:1.
      1. Из-за высокой концентрации клеток первоначально разбавляют 10 мкл клеток 1:100 с DPBS; затем смешайте 10 мкл разбавленных ячеек в соотношении 1:100 с 10 мкл раствора трипанового синего для окончательного разведения в соотношении 1:1. При использовании автоматического счетчика ячеек корректируйте количество клеток, чтобы отразить 200-кратное разведение, умножив указанную концентрацию на 100, так как большинство счетчиков предполагают 2-кратное разведение. Ожидайте урожай 1-2,5 × 109 PBMC от лейкопака 1/10.
  2. Выделение CD4+ Т-клеток (отрицательный отбор)
    1. Раскрутите 108-10 9 PBMCs при 500 × g в течение 5 мин при RT и ресуспендируйте в буфере для разделения клеток (DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS) при 5 × 107 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить достаточное количество человеческих Tregs для генетической модификации, мы рекомендуем начать с 1 ×10 9 PBMC.
    2. Проводите магнитную сепарацию в соответствии с инструкциями производителя для набора для обогащения CD4+ Т-клеток.
    3. Определить количество выделенных CD4+ Т-клеток путем подсчета с помощью трипанового синего (10 мкл клеток + 10 мкл трипанового синего).
  3. Выделение CD8+ Т-клеток (отрицательный отбор)
    1. Спин 5 ×10 7 PBMCs при 500 × g в течение 5 мин при RT. Ресуспендирование в буфере для разделения клеток (DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS) при 5 × 107 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем начинать с 5 × 107 PBMC для получения 2-5 ×10 6 CD8+ Т-клеток.
    2. Проводите магнитную сепарацию в соответствии с инструкциями производителя для набора для обогащения CD8+ Т-клеток.
    3. Определите количество выделенных CD8+ Т-клеток путем подсчета с помощью трипанового синего (10 мкл клеток + 10 мкл трипанового синего).
  4. Флуоресцентная сортировка клеток Treg (FACS)
    1. Выделите CD4+ Т-клетки, как описано в шаге 1.2, и храните их на ночь в DPBS с 2% FBS при 4 °C (минимальная потеря количества клеток и жизнеспособности) для FACS на следующий день. Определите количество CD4+ Т-клеток с шага 1.2 путем подсчета с помощью трипанового синего (10 мкл клеток + 10 мкл трипанового синего).
    2. Вращайте CD4+ клетки при 500 × г в течение 5 минут. Восстановите клетки в 200 мкл DPBS.
    3. На 1 × 106 клеток добавить 1 мкл античеловеческого CD4 FITC, 1 мкл античеловеческого CD25 APC и 1 мкл античеловеческого CD127 PE. Аккуратно перемешайте и поставьте в темный холодильник при температуре 4 °C на 30 минут.
    4. Промойте клетки 10 мл DPBS с 2% FBS. Вращайте при 500 × г в течение 5 минут. Аккуратно ресуспендируйте окрашенные клетки в концентрации 1,5 ×10 7 клеток/мл в DPBS с 2% FBS. Это рекомендуемая концентрация клеток для сортировки с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS).
    5. Пропустите окрашенную клеточную суспензию через фильтрующий колпачок 40 мкм в пробирки FACS, а затем держите пробирки на льду.
    6. Приготовьте 15 мл пробирок для сбора, содержащих 3 мл среды RPMI10, и положите на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта среда состоит из RPMI1640 базальной среды, 10% FBS, 1x пенициллин-стрептомицина, 1x L-аланил-L-глютамина, 1x заменимых аминокислот, 1x пирувата натрия и 1x HEPES.
    7. Отсортируйте CD4+CD25с высокимуровнем CD127-регуляторных Т-клеток (Tregs) и CD4+CD25с низким уровнемCD127+ обычных Т-клеток (Tconv) с помощью FACS, как показано на рисунке 1A.
    8. Определение выхода и жизнеспособности клеток; затем следует провести анализ или активацию Т-клеток.

2. Активация Т-клеток

  1. Подсчитайте выделенные Т-клетки с трипановым синим (10 мкл клеток + 10 мкл трипанового синего).
  2. Промойте 25 мкл анти-CD3/CD28 гранул (106 шариков) на каждые 1 × 106 Т-клеток, поддерживая соотношение гранул и Т-клеток 1:1. Промойте анти-CD3/CD28 гранулы, добавив DPBS, инкубируя на магните в течение 3 минут и удалив теперь уже разбавленный буфер анти-CD3/CD28, который может быть токсичным для клеток.
  3. Снимите трубку с магнита и снова суспендируйте промытые шарики в среде RPMI10, чтобы получилось 1 × 106 шариков/1 мл RPMI10.
  4. Ресуспендируйте Т-клетки с анти-CD3/CD28 гранулами в среде RPMI10 в концентрации 1 × 106 Т-клеток/мл. Затем добавьте 1000 МЕ/мл IL-2 к Treg-клеткам, 100 МЕ/мл IL-2 к CD4+ Tconv-клеткам и 300 МЕ/мл IL-2 к CD8+ Т-клеткам.
  5. Культивирование Т-клеток в 1 × 106 клеток в лунку 24-луночного планшета с различным количеством анти-CD3/CD28 гранул и IL-2. Поместите 24-луночный планшет в инкубатор для культуры тканей с температурой 37 °C и 5% CO2 .
  6. Расширяйте активированные Т-клетки в течение 9-12 дней в присутствии IL-2 до использования для экспериментов или повторной активации с помощью анти-CD3/CD28 гранул для дополнительной экспансии. Заменяйте среду каждые 2-3 дня и добавляйте IL-2 каждый раз при добавлении свежей среды. Поддерживайте плотность ячеек Tregs на уровне 5 × 10до 1 ×10 6 клеток на мл во время расширения, подсчитывая ячейки или проводя визуальный осмотр перед расщеплением.

3. Лентивирусная трансдукция Treg человека

  1. Повторная приостановка и подсчет Tregs через 48 часов после активации. Вращать при 500 ×g в течение 5 мин при РТ. Ресуспендировать Tregs в RPMI10 при 1,25 ×10 6 клеток/мл с 1000 МЕ/мл IL-2.
  2. Разогрейте центрифугу до 32 °C.
  3. Разморозьте лентивируссодержащую конструкцию CAR на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы храним одноразовые аликвоты лентивируса с достаточным количеством лентивируса для трансдукции 2,5 × 105 клеток при MOI 1 при -80 °C.
  4. Добавить в каждую аликвоту лентивируса по 2,5 ×10 5 Трег по 200 мкл в микроцентрифужную пробирку, каждая пробирка должна указывать на реакцию. Спинокулировать в дозе 1 000 × г в течение 1 ч при 32 °C.
  5. Переместите каждую реакцию объемом 200 мкл в 24-луночный планшет. Убедитесь, что носитель покрывает всю лунку. Инкубируйте 24-луночный планшет с трансдуцированными Tregs в инкубаторе для тканевых культур в течение ночи (16-18 ч). Доливайте в каждую лунку до 2 мл среду RPMI10 с конечной концентрацией IL-2 1000 МЕ/мл.
  6. Продолжайте наращивать трансдуцированные Tregs через 9-12 дней после активации, разделяя клетки и добавляя свежие предварительно подогретые RPMI10 и IL-2 по мере необходимости (каждые 2-3 дня). Идеальная концентрация клеток составляет 5 × 105-1 × 106 клеток/мл.
  7. Оцените эффективность модификации генов с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наши лентивирусные конструкции CAR содержат Myc-метку на N-конце гена CAR и репортерный ген GFP, связанный с геном CAR пептидом 2A, что позволяет количественно оценить эффективность трансдукции без окрашивания антителами (GFP) и подтвердить поверхностную экспрессию CAR (Myc-метка). Мы оцениваем эффективность модификации генов через 5 дней после трансдукции. Эффективность трансдукции может варьироваться от 30% до 70% в зависимости от донора и используемой конструкции CAR. При желании ячейки CAR+ можно отсортировать.
  8. Убедитесь, что модифицированные Tregs завершают свой цикл активации (9-12 дней) и отдыхают 24 часа в отсутствие IL-2 перед использованием в любых экспериментах.

4. CRISPR/Cas9-опосредованный ген в человеческих Tregs

  1. Ресуспендировать Tregs и перенести в коническую пробирку объемом 15 мл через 48 ч после активации. Инкубируйте клеточную суспензию в магните в течение 3 минут.
  2. Находясь в магните, перенесите клетки в среде с помощью пипетки в новую пробирку. Шарики, анти-CD3/CD28, останутся прикрепленными к стенке трубки. Дайте очищенным от бисера отвариться в RPMI10 в течение 2 часов после удаления валика, чтобы восстановиться от непосредственного напряжения при удалении швов, повышая эффективность будущей трансдукции и восстановление после электропорации.
  3. Посчитайте очищенные от бисера треги с трипановым синим.
  4. Предварительно подогреть среду с уменьшенной сывороткой без FBS до 37 °C.
  5. Приготовьте 6-луночный планшет с 2,5 мл среды RPMI10 без антибиотиков (пенициллин-стрептомицин) и с 1000 МЕ/мл ИЛ-2 на лунку. Разогрейте планшет до 37 °C в инкубаторе для тканевых культур.
  6. Разморозьте на льду шаблон CAR-направленной репарации (HDR), содержащего аденоассоциированный вирус (AAV).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы храним одноразовые аликвоты с достаточным количеством AAV для заражения 4 × 106 клеток при MOI 20 000 при -80 °C.
  7. Отжим при 500 × г в течение 5 минут. После сцеживания надосадочной жидкости ресуспендировать клетки в предварительно подогретую среду с восстановленной сывороткой в концентрации 4 × 107 клеток/мл.
  8. Аликвотные клетки в 100 мкл в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл с низким связыванием белков. Добавьте CAR AAV с MOI 20 000 к каждому образцу и повторите. Инкубировать реакционные пробирки в инкубаторе для тканевых культур в течение 1 ч.
  9. Во время инкубации в течение 1 ч готовят и собирают комплексы рибонуклеопротеинов (РНП) CRISPR/Cas9 путем медленного добавления 8,3 мкл белка Cas9 (1 мг/мл стока) к 2,5 мкл гРНК, нацеленной на локус гена TRAC (100 мкМ запаса) для получения молярного соотношения Cas9 к sgРНК 1:1 и общего объема РНП 10,8 мкл на образец. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз, чтобы перемешать. Инкубировать смесь РНП в течение 15 мин при температуре 37°С в инкубаторе для тканевых культур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Комплексы RNP могут оставаться в RT после этого до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.
  10. Заполните свежую электропорационную трубку (E-трубку) 3 мл высокоосмолярного электропориционного буфера. Вставьте заполненную E-трубку в пипетную станцию системы электропорации до щелчка. Установите условия электропорации на 2 200 В, 20 мс, 1 импульс в системе электропорации.
  11. После завершения 1-часовой инкубации с AAV вращайте клетки с AAV при 300 × g в течение 5 мин при RT. Осторожно отасканируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл буфера для ресуспензии клеток, полученного с помощью системы электропорации для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро и не оставляйте ячейки в буфере дольше 15 минут. Избегайте образования пузырей.
  12. Добавьте 10,8 мкл комплекса РНП на образец. Хорошо перемешайте пипеткой, не создавая пузырьков.
  13. Вставьте наконечник для электропорации объемом 100 μL, нажав на пипетку до второго упора, чтобы открыть зажим. Поместите верхнюю головку пипетки в наконечник электропорации до тех пор, пока зажим надежно не войдет в зацепление с монтажным стержнем поршня. Постепенно отпускайте кнопку, сохраняя давление на пипетку вниз, чтобы наконечник плотно прилегал к пипетке без зазоров.
  14. Нажмите на пипетку до первой остановки и погрузите наконечник электропорации в смесь клетка-РНП. Аккуратно потяните образец вверх в пипетку без пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время электропорации внутри наконечника не должно быть пузырьков.
  15. Вставьте пипетку с установленным наконечником для электропорации, содержащим образец, вертикально в E Tube до тех пор, пока не раздастся щелчок. Избегайте образования пузырьков.
  16. Убедитесь, что введены оптимальные настройки для человеческих Tregs (2 200 В, 20 мс, 1 импульс) и нажмите «Пуск » на сенсорном экране, чтобы электропорировать элементы.
  17. Подождите, пока на сенсорном экране не появится сообщение «Завершено » после завершения электропорации. Аккуратно извлеките пипетку и немедленно переложите образец в подготовленный 6-луночный планшет, содержащий 2,5 мл предварительно подогретой среды RPMI10 без антибиотиков с 1000 МЕ/мл IL-2 на лунку. Повторите то же самое с оставшимися образцами. Осторожно покачивайте планшет линейными движениями (слева направо, сверху вниз), чтобы обеспечить равномерное распределение клеток в каждой лунке, и поместите его в инкубатор для тканевых культур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное использование наконечника для электропорации допустимо до 3 раз, если используются одни и те же элементы и комплекс RNP. Подождите 30-минутный период восстановления, прежде чем подсчитывать клетки или нарушать их каким-либо образом, например, при желании добавить усилитель HDR.
  18. На следующий день, через 16-18 ч, замените среду на среду, содержащую антибиотики, подсчитайте электропорированные Tregs трипановым синим и заквашивайте 106 клеток/мл с 1000 МЕ/мл IL-2. Продолжайте наращивать электропорированные Tregs, расщепляя клетки и добавляя свежие RPMI10 и IL-2, как описано в шаге 2.6.
  19. Держите образцы на льду для анализа с помощью проточной цитометрии.
    1. Настройте элементы управления одноцветной компенсацией и примените их к файлу эксперимента.
    2. Сначала прочтите неокрашенный образец, чтобы скорректировать прирост FSC и SSC так, чтобы популяция лимфоцитов находилась в середине точечной диаграммы «Все события».
    3. Настройте стратегию гейтирования лимфоцитов в не-распадовые/одиночные клетки в жизнеспособные клетки в CD4+ клетки, как показано на рисунке 3C.
  20. Оценка эффективности модификации генов с помощью проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наши конструкции AAV CAR содержат, в дополнение к группам гомологии локуса TRAC, репортерный ген рецептора эпидермального фактора роста (EGFRt), связанный с геном CAR пептидом 2A, как показано на рисунке 3. Эффективность нок-ина гена определяется поверхностным окрашиванием CD3, потеря которого указывает на потерю поверхностной экспрессии TCR и, следовательно, на успешное нацеливание на локус TRAC с помощью CRISPR/Cas9, и EGFRt, экспрессия которого указывает на успешную интеграцию трансгена CAR. Вбивные треги CAR представляют собой элементы CD3-EGFRt+. Мы оцениваем эффективность модификации генов через 5 дней после электропорации.
  21. Убедитесь, что модифицированные Tregs завершили свой цикл активации (9-12 дней) и отдохнули 24 часа в отсутствие IL-2 перед использованием в любых экспериментах.

5. Активация Human CAR Treg

  1. Организация совместного проживания (день 0)
    1. Соберите линию клеток-мишеней, экспрессирующих антиген CAR, в коническую пробирку.
      Примечание: Мы используем клетки K562, линию клеток миелолейкоза человека, в которой отсутствует экспрессия HLA, CD80 и CD86 в качестве клеток-мишеней для активации CAR Treg. Родительские клетки K562 используются в качестве отрицательного контроля, а антиген-экспрессирующие CAR K562 используются для активации CAR Tregs17,21.
    2. Облучайте целевые клеточные линии 4000 рад в цезий-137 или рентгеновском облучателе. В случае отсутствия доступа к облучателю проводят обработку митомицином С для остановки пролиферации клеток с сохранением экспрессии поверхностного антигена в клетках-мишенях22.
    3. Если вы еще этого не сделали, удалите Tregs, повторно суспендируя Tregs, связанные с анти-CD3/CD28 шариками, и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Инкубируйте клеточную суспензию в магните в течение 3-5 минут. Пока вы еще находитесь в магните, перенесите клетки в среде с помощью пипетки в новую пробирку; шарики, анти-CD3/CD28, останутся прикрепленными к стенке трубки.
    4. Определите концентрации облученной целевой клетки и обездоленного CAR Treg с помощью трипанового синего.
    5. Вращать облученные клетки-мишени и CAR Tregs в дозе 500 × g в течение 5 мин. Ресуспендируйте предварительно подогретым RPMI10 при давлении10 6 клеток/мл в отдельных пробирках. Добавляйте IL-2 в CAR Tregs для концентрации 2000 МЕ/мл.
      Примечание: Это количество IL-2 будет разбавлено в 2 раза после объединения CAR Tregs с клетками-мишенями для получения конечной концентрации IL-2 1000 МЕ/мл.
    6. Совместное культивирование 1 × 105 CAR Tregs (100 μL) с 1 × 105 ( 100 μL) CAR-антиген-отрицательных, облученных клеток-мишеней (отрицательный контроль для активации), 1 × 105 ( 100 μL) CAR-положительных клеток-мишеней (эксперимент) или 2,5 мкл анти-CD3/CD28 гранул (положительный контроль для активации) и 97,5 μл среды RPMI10 в 96-луночной круглой нижней пластине. Поместите планшет в инкубатор для культур тканей с температурой 37 °C, 5% CO2 на 48 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем на лунку составляет 200 μл. Убедитесь, что каждое условие имеет три повторения.
  2. Считывание проточной цитометрии
    1. Если вы не используете считыватель планшетов, подвешивайте содержимое каждой лунки из пластины с круглым дном 96 лунок и переложите его в трубку FACS. Вращайте при 500 x g в течение 5 минут. Сцедите надосадочную жидкость и аккуратно сделайте вихрь клеточной гранулы.
    2. Приготовьте мастер-смесь антител для проточной цитометрии: 100 мкл/образец, содержащий DPBS, античеловеческий CD4 PE/Cy7 1:200, античеловеческий CD71 PE 1:100 и краситель Ghost Viability BV510 1:2000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта панель хорошо работает, если репортерный ген CAR является GFP. Если репортерный ген кодирует поверхностный белок, требующий окрашивания антителами, такой как EGFRt, можно использовать, например, антитело, конъюгированное с FITC.
    3. Внесите пипеткой 100 мкл мастер-смеси антител в каждый образец, аккуратно перемешайте и инкубируйте в течение 30 минут в холодильнике при температуре 4 °C.
    4. Промыть 500 μл DPBS путем отжима при 500 × г в течение 5 минут. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл DPBS.
    5. Держите образцы на льду для анализа с помощью проточной цитометрии.
      1. Настройте элементы управления одноцветной компенсацией и примените их к файлу потока эксперимента.
      2. Считайте неокрашенные образцы, чтобы скорректировать прирост SSC и FSC так, чтобы популяция лимфоцитов находилась в середине точечной диаграммы «Все события».
      3. Настройте стратегию гейтирования лимфоцитов в нераспадувочные клетки/одиночные клетки в жизнеспособные клетки в CD4+ клетки, как показано на рисунке 3C (Используемые различные флуорофоры).
      4. Чтение образцов с частотой событий примерно 1500 событий/с для оценки активации Treg.
        Примечание: Ожидаемым результатом является повышение экспрессии поверхности CD71 в CAR Tregs в присутствии антигена CAR, как показано на рисунке 4. Если повышенная регуляция не наблюдается в присутствии антигена CAR, то может присутствовать тоническая сигнализация.

6. Устойчивость Human CAR Treg

  1. Создание и расширение кокультуры (дни 0-9)
    1. Настройте совместные культуры для активации CAR Tregs, как описано в шаге 5.1.
    2. Через 48 ч перенесите кокультуру из каждой 96-луночной лунки с круглым дном в лунку с 24-луночным планшетом, содержащую предварительно подогретые 2 мл RPMI10 с 1000 МЕ/мл IL-2 для обеспечения расширения клеток.
    3. Добавьте свежий предварительно подогретый RPMI10 с 1 000 МЕ/мл IL-2 и разделите на дополнительные 24-луночные планшеты по мере необходимости.
  2. Считывание проточной цитометрии
    1. Ресуспендируйте и перенесите содержимое каждой реплики в коническую пробирку объемом 15 мл или 50 мл. Определите концентрацию клеток.
    2. Переносите между 5 × 10,5 и 1 × 106 клеток в пробирку FACS для каждой репликации. Крутите при 500 × г в течение 5 минут.
    3. Приготовьте мастер-смесь антител для проточной цитометрии для окрашивания поверхности: 100 мкл/образец, содержащий DPBS, античеловеческий CD4 PE/Cy7 1:200, античеловеческий CD25 APC 1:200 и краситель Ghost Viability BV510 1:2000. При необходимости включите конъюгированное с FITC антитело к репортерному белку CAR.
    4. Сцедите надосадочную жидкость с шага 6.2.2 и аккуратно перебейте гранулу клетки. Пипетка 100 мкл основной смеси поверхностно окрашивающих антител в каждую пробирку FACS. Кратковременно перемешайте и поставьте в холодильник при температуре 4 °C на 30 минут в темноте.
    5. Используя набор буферов для окрашивания транскрипционного фактора, приготовьте буфер для фиксации/пермеабилизации, добавив 3 объема разбавителя фиксации/пермеабилизации к 1 объему концентрата фиксации/пермеабилизации. Для каждого образца требуется 100 мкл буфера для фиксации/пермеабилизации.
    6. Поверхностные окрашенные элементы промыть 500 μл DPBS. Вращать при 500 × г в течение 5 минут и сцедить надосадочную жидкость. Пипеткой нанесите 100 мкл подготовленного буфера для фиксации/пермеабилизации в каждую пробирку. Кратковременно переведите вихрь и дайте закрепиться при температуре 4 °C в течение 30-60 минут в темноте.
    7. Используя набор буферов для окрашивания транскрипционного фактора, приготовьте 1x Permeabilization buffer, добавив 9 объемов дистиллированной воды к 1 объему концентрата Permeabilization Buffer 10x. Для каждого образца требуется 1000 μL Permeabilization buffer для промывки и 100 μL Permeabilization buffer для окрашивания антителами, нацеленными на внутриклеточные белки.
    8. Промойте фиксированные/пермеабилизированные клетки, добавив 500 мкл 1x пермеабилизационного буфера. Вращайте при 500 × г в течение 5 минут при RT.
    9. Приготовьте мастер-смесь для внутриклеточного окрашивания антител с 1x буфером для пермеабилизации, античеловеческим FOXP3 eFluor 450 1:50, античеловеческим HELIOS PE 1:50 и античеловеческим CTLA-4 PerCP-e710 1:50. Для каждого образца потребуется 100 мкл мастер-смеси антител.
      Примечание: Эта панель работает, если репортерный ген CAR является GFP или если репортерный белок CAR (например, EGFRt) окрашен FITC-конъюгированным антителом.
    10. Сцедите надосадочную жидкость с шага 6.2.8. Добавьте 100 мкл мастер-смеси внутриклеточных окрашивающих антител, кратковременно сделайте вихрь и инкубируйте при ОТ в течение 30 минут в темноте.
    11. Промойте окрашенные неподвижные/пермеабилизированные клетки, добавив 500 мкл 1x пермеабилизационного буфера. Вращайте при 500 × г в течение 5 минут. Сцедите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 300 мкл DPBS и храните ее на льду.
    12. Проанализируйте с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 5. Ожидаемый результат заключается в том, что большинство CAR Tregs будут FOXP3+HELIOS+ ячейками. Используйте клетки CD4+ Tconv в качестве отрицательного контроля для окрашивания FOXP3 и HELIOS.

7. Подавление CAR Treg человека

  1. Ответчик Т-клеток (Tresp) окрашивание следовым красителем и ночная активация
    1. Соберите расширенные клетки CAR Treg, свежевыделенные CD4+ Tconv клетки и свежевыделенные CD8+ Т-клетки в отдельные конические пробирки объемом 15 мл и удалите анти-CD3/CD28 гранулы, если это еще не сделано.
    2. Подготовьте облученные клетки-мишени, экспрессирующие антиген CAR, как описано в шаге 5.1.
    3. Определение концентраций неактивированных Т-клеток и облученных клеток-мишеней.
    4. Объедините 5 × 106 CD4+ Tconv клеток с 5 × 106 CD8+ T-клетками (соотношение 1:1). Это Т-клетки-ответчики (Tresp), которые должны быть ингибированы CAR Tregs в анализе. Вращайте клетки Tresp в дозе 500 × г в течение 5 мин в режиме РТ. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки Tresp в 1 мл DPBS.
    5. Добавьте 1 мл 5 мМ красителя CellTrace Violet (CTV), восстановленного в ДМСО, к 10клеткам 7 Tresp в 1 мл DPBS для получения конечной концентрации 5 мкМ CTV. Поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 20 минут. На 10 мин аккуратно перераспределите осевший CTV.
    6. Умойтесь 9 мл предварительно подогретой среды RPMI10. Вращать при 500 × г в течение 5 минут. Ресуспендируйте в 5 мл предварительно подогретой среды RPMI10.
    7. Определите концентрацию меченых CTV клеток Tresp. Добавьте 5 × 104 меченых CTV неактивированных элементов Tresp в 200 мкл среды RPMI10 в 3-6 лунок 96-луночного планшета с круглым дном в качестве минимального контроля пролиферации.
    8. Активируйте меченые CTV клетки Tresp с помощью анти-CD3/CD28 гранул в соотношении гранул к клеткам Tresp 1:10 без IL-2 в среде RPM10. Диспонируйте 106 меченых CTV клеток Tresp в 1 мл среды RPMI10 на лунку 24-луночного планшета в инкубаторе для тканевых культур на ночь.
    9. Параллельно получите 106 CAR+ Tregs. Это количество покрывает тройки из четырех соотношений CAR Treg:Tresp, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, при 5 × 104 целевых ячейках на 96-луночный колодец с круглым дном, как 5 × 104 × 3 + 2,5 × 104 × 3 + 1,25 × 104 × 3 + 0,625 × 104 × 3 = 2,81 × 105 CAR Tregs, в двух условиях активации CAR Treg: облученные CAR-антиген-отрицательные клетки-мишени (отрицательный контроль, без активации) и облученные CAR-антиген-положительные клетки-мишени (эксперимент, активация CAR).
    10. Соедините 3 × 105 CAR Tregs с 3 × 105 облученными CAR антиген-отрицательными клетками (соотношение 1:1) и 3 × 105 CAR Tregs с 3 ×10 5 облученными CAR антиген-положительными клетками-мишенями (соотношение 1:1) в двух отдельных конических пробирках объемом 15 мл и вращайте при 500 × г в течение 5 мин в RT. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость.
    11. Повторно суспендируйте гранулу в каждой пробирке с шага 7.1.10 в 600 мкл предварительно подогретой среды RPMI10. В результате получается 200 мкл для каждого из трипликаторов Treg:Tresp 1:1. Выполните последовательное разведение на 96-луночном планшете с круглым дном следующим образом:
      1. Из приготовленных 600 мкл клеточной суспензии Treg + мишени пипетируйте 200 мкл клеточной суспензии в каждую из 3 лунок соотношения 1:1.
      2. Добавьте 100 мкл предварительно подогретой среды RPMI10 в каждую из пустых лунок с соотношением 1:2, 1:4 и 1:8.
      3. Для каждого из трипликатов пипетку 100 мкл клеточной суспензии из лунок 1:1 в соответствующие лунки с соотношением 1:2.
      4. Для каждого из трипликатов пипетку 100 мкл клеточной суспензии из лунок 1:2 в соответствующие лунки с соотношением 1:4.
      5. Для каждого из трипликатов пипетируйте 100 мкл клеточной суспензии из лунок 1:4 в соответствующие лунки с соотношением 1:8.
      6. Пипеткой направьте оставшиеся 100 мкл клеточной суспензии из лунок с соотношением 1:8 в контейнер для отходов.
        Примечание: Каждая лунка должна содержать 100 мкл клеточной суспензии с 5 × 104 (1:1), 2,5 × 104 (1:2), 1,25 × 104 (1:4), или 0,625 × 104 (1:8) CAR Tregs и равное количество облученных клеток-мишеней.
  2. Коинкубация клеток CAR Treg и Tresp
    1. Через 16-18 часов после активации соберите активированные клетки Tresp из 24-луночного планшета в коническую трубку и удалите анти-CD3/CD28 шарики с помощью магнита.
    2. Определите количество меток Tresp, меченных CTV.
    3. Промыть и отжать 2 × 106 ячейках Tresp при 500 × г в течение 5 мин. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 4 мл полной среды RPMI10.
    4. Добавьте 100 мкл суспензии Т-клеток (5 × 104 Т-клеток) в каждую лунку с CAR Tregs, а также в 3-6 лунок с 100 мкл только среды RPMI10 для максимального контроля пролиферации. Поместите планшет в инкубатор для культур тканей с температурой 37 °C и 5%CO2 на 72 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 96-луночный планшет с круглым дном теперь имеет 3-6 лунок только с неактивированными клетками Tresp (минимальный контроль пролиферации), 3-6 лунок только с активированными клетками Tresp (максимальный контроль пролиферации) и активированные клетки Tresp в присутствии уменьшающегося количества CAR Tregs.
  3. Считывание проточной цитометрии
    1. Повторно суспензируйте и перенесите содержимое каждой 96-луночной круглой нижней пластины в пробирку с маркировкой FACS. В качестве альтернативы можно перевести на 96-луночный планшет с V-образным дном, если доступен проточный цитометр с режимом считывания показаний планшета. Отжим при 500 × г в течение 5 мин.
    2. Тем временем приготовьте мастер-смесь антител с DPBS, античеловеческим CD4 PE/Cy7 1:200 и античеловеческим CD8 PerCP 1:200. Для каждого образца потребуется 100 мкл мастер-смеси антител.
    3. Аккуратно перебейте клеточную гранулу в вортс. Пипеткой нанесите 100 мкл мастер-смеси антител в каждую пробирку FACS. Кратковременно сделайте вихрь и инкубируйте при температуре 4 °C в течение 30 минут в темноте.
    4. Вымойте 500 μL DPBS. Промойте 2 раза 100 мкл DPBS при использовании 96-луночного V-образного дна. Вращайте при 500 × г в течение 5 минут. Сцедите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл DPBS и храните пробирки на льду в темноте.
    5. Проанализируйте с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 6. Ожидаемым результатом являются неактивированные клетки Tresp (минимальная пролиферация) с равномерным высоким пиком флуоресценции CTV, только активированные клетки Tresp с демонстрацией нескольких пиков интенсивности CTV, по одному соответствующему каждому делению клетки (максимальная пролиферация), и активированные CD4+ и CD8+ Т-клетки в присутствии активированных CAR Tregs, демонстрирующие уменьшение количества и высоты пиков CTV. следовательно, в распространении.
    6. Вычислите подавление Treg-cell следующим образом:
      figure-protocol-32098
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании программного обеспечения FlowJo также можно использовать моделирование пролиферации клеток для расчета индекса деления (DI) для каждого образца и расчета процента подавления с использованием DI вместо процента пролиферирующих клеток в приведенной выше формуле.

Результаты

Описанный здесь протокол обеспечивает оптимизированный и стандартизированный конвейер для оценки новых конструкций химерных антигенных рецепторов (CAR) в регуляторных Т-клетках человека (Tregs) с целью создания живых терапевтических средств для лечения аутоиммунных з?...

Обсуждение

Этот протокол предоставляет оптимизированную и всестороннюю методологию для генерации и оценки химерных антигенных рецепторов регуляторных Т-клеток человека (CAR Tregs). Успех технологии CAR в лечении гематологических раковых заболеваний вдохновил на ее применение к им?...

Раскрытие информации

LMRF является изобретателем и получает роялти от патентов на сконструированные иммунные клетки, а также консультирует Guidepoint Global и McKesson. Остальные авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

LMRF финансируется грантом Human Islet Research Network (HIRN) «Новый лидер в области диабета 1 типа» U24DK104162-07, грантом Американского онкологического общества (ACS) на институциональные исследования IRG-19-137-20, грантом на открытие пилотного проекта Южной Каролины Clinical and Translational Research (SCTR) 1TL1TR001451-01, грантом Diabetes Research Connection (DRC) IPF 22-1224 и грантом Swim Across America 23-1579. RWC поддерживается грантом на обучение в области клеточных, биохимических и молекулярных наук T32GM132055 и стипендией для выпускников Онкологического центра Холлингса Lowvelo. Это исследование было частично поддержано Общим ресурсом проточной цитометрии и сортировки клеток, Онкологический центр Холлингса, Медицинский университет Южной Каролины (P30 CA138313). Особая благодарность доктору Цичжи Тану из Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF) за любезный подарок мутантным плазмидам CAR.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adeno-associated virus (AAV)Charles River Laboratories
CAR target-expressing K562 cellse.g., CD19-K562
Cesium-137 irradiator
Anti-human CD8 PerCP (clone SK1)Biolegend344708
Anti-human CD4 PE/Cy7 (clone SK3)Biolegend344612
DynaMag-15 magnetThermoFisher12301D
Ghost BV510 viability dye TONBO13-0870-T100
K562 cellsAmerican Type Culture CollectionCCL-243
0.5 M EDTA, pH 8.0Gibco 15575020
1 M HEPESGibco15630080
Ammonium chloride solutionSTEMCELL Technologies7850
Anti-human CD127 PE (clone hIL-7R-M21)BD Biosciences557938
Anti-human CD25 APC (clone BC96)Biolegend 302610
Anti-human CD4 FITC (clone SK3)Biolegend 344604
Anti-human CD71 PE (clone SK1)Biolegend334106
Anti-human CD8 PerCP (clone SK1)Biolegend 344707
Anti-human CTLA-4 PerCP-e710ThermoFisher46-1529-42
Anti-human EGFR APC (clone AY13)Biolegend352905
Anti-human FOXP3 eFluor 450ThermoFisher48-4776-42
Anti-human HELIOS PEBiolegend137216
Ca2+ and Mg2+ free Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco14190144
Cell counter (TC20 Automated Cell Counter)Bio-Rad1450102
Cell Counting SlidesBio-Rad1450016
CellTrace Violet Cell Proliferation KitThermoFisherC34571
DNA LoBind TubesEppendorf22431021
Easy 50 EasySep magnet STEMCELL Technologies18002
EasySep Human CD4+ T cell Enrichment KitSTEMCELL Technologies19052
EasySep Human CD8+ T cell Enrichment KitSTEMCELL Technologies19053
EasySep magnet STEMCELL Technologies18000
eBioscience Foxp3 transcription factor staining buffer setThermoFisher00-5523-00
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mLFisher Scientific08-771-2340μm
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2
Fluorescence-activated cell sorterBD BiosciencesFACS Aria III Cell Sorter
GlutaMAXGibco35050061
Human CD3/28 T Cell Expansion and Activation DynabeadsGibco11131D
Invitrogen Neon Transfection SystemThermoFisher10431915
Invitrogen Neon Transfection System 100 μL KitThermoFisher10114334
LentivirusVectorBuilder
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco11140050
Myc Tag antibody A647 (clone 9B11)Cell Signaling Technologies2233S
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Penicilin-Streptomycin solutionGibco15140122
Recombinant human interleukin-2 (rhIL-2)Peprotech200-02
RPMI 1640 medium, no glutamine Gibco11875093
Sodium pyruvateGibco11360070
Spectral Flow CytometerCytekNorthern Lights
TRAC gRNASynthegoSequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT)
TrueCut Cas9 Protein v2ThermoFisherA36496
Trypan Blue solution Sigma T8154-100ML
1/10 LeukopakSTEMCELL Technologies200-00921-2 billion PBMC

Ссылки

  1. Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153 (2022).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: what we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Choi, B. D., et al. Intraventricular CARv3-TEAM-E T cells in recurrent glioblastoma. N Engl J Med. 390 (14), 1290-1298 (2024).
  4. Brown, C. E., et al. Locoregional delivery of IL-13Ralpha2-targeting CAR-T cells in recurrent high-grade glioma: a phase 1 trial. Nat Med. 30 (4), 1001-1012 (2024).
  5. Bagley, S. J., et al. Intrathecal bivalent CAR T cells targeting EGFR and IL13Ralpha2 in recurrent glioblastoma: phase 1 trial interim results. Nat Med. 30 (5), 1320-1329 (2024).
  6. Ghobadinezhad, F., et al. The emerging role of regulatory cell-based therapy in autoimmune disease. Front Immunol. 13, 1075813 (2022).
  7. Sakaguchi, S., Yamaguchi, T., Nomura, T., Ono, M. Regulatory T cells and immune tolerance. Cell. 133 (5), 775-787 (2008).
  8. Sakaguchi, S., et al. Regulatory T cells and human disease. Annu Rev Immunol. 38, 541-566 (2020).
  9. Ferreira, L. M. R., Muller, Y. D., Bluestone, J. A., Tang, Q. Next-generation regulatory T cell therapy. Nat Rev Drug Discov. 18 (10), 749-769 (2019).
  10. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Sci Transl Med. 4 (125), 125sr121 (2012).
  11. Sawitzki, B., et al. Regulatory cell therapy in kidney transplantation (The ONE Study): a harmonised design and analysis of seven non-randomised, single-arm, phase 1/2A trials. Lancet. 395 (10237), 1627-1639 (2020).
  12. Spanier, J. A., et al. Tregs with an MHC class II peptide-specific chimeric antigen receptor prevent autoimmune diabetes in mice. J Clin Invest. 133 (18), e168601 (2023).
  13. Muller, Y. D., et al. Precision engineering of an anti-HLA-A2 chimeric antigen receptor in regulatory T cells for transplant immune tolerance. Front Immunol. 12, 686439 (2021).
  14. MacDonald, K. G., et al. Alloantigen-specific regulatory T cells generated with a chimeric antigen receptor. J Clin Invest. 126 (4), 1413-1424 (2016).
  15. Boardman, D. A., et al. Flagellin-specific human CAR Tregs for immune regulation in IBD. J Autoimmun. 134, 102961 (2023).
  16. Schreeb, K., et al. Study design: human leukocyte antigen Cclass I molecule A(*)02-chimeric antigen receptor regulatory T cells in renal transplantation. Kidney Int Rep. 7 (6), 1258-1267 (2022).
  17. Zimmerman, C. M., Robino, R. A., Cochrane, R. W., Dominguez, M. D., Ferreira, L. M. R. Redirecting human conventional and regulatory T cells using chimeric antigen receptors. Methods Mol Biol. 2748, 201-241 (2024).
  18. Tang, Q., et al. Selective decrease of donor-reactive T(regs) after liver transplantation limits T(reg) therapy for promoting allograft tolerance in humans. Sci Transl Med. 14 (669), eabo2628 (2022).
  19. Bender, C., et al. A phase 2 randomized trial with autologous polyclonal expanded regulatory T cells in children with new-onset type 1 diabetes. Sci Transl Med. 16 (746), eadn2404 (2024).
  20. Ferreira, L. M. Conference report: Advanced Therapies Week 2023. Regen Med. 18 (4), 297-299 (2023).
  21. Cochrane, R. W., et al. How to test human CAR T cells in solid tumors, the next frontier of CAR T cell therapy. Methods Mol Biol. 2748, 243-265 (2024).
  22. Roy, A., Krzykwa, E., Lemieux, R., Neron, S. Increased efficiency of gamma-irradiated versus mitomycin C-treated feeder cells for the expansion of normal human cells in long-term cultures. J Hematother Stem Cell Res. 10 (6), 873-880 (2001).
  23. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
  24. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Bjorklund, T., Davidsson, M. AAV Production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103 (2020).
  25. Velasco Cardenas, R. M., et al. Harnessing CD3 diversity to optimize CAR T cells. Nat Immunol. 24 (12), 2135-2149 (2023).
  26. Boomer, J. S., Green, J. M. An enigmatic tail of CD28 signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (8), a002436 (2010).
  27. Suhoski, M. M., et al. Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules. Mol Ther. 15 (5), 981-988 (2007).
  28. Fung, V. C. W., Rosado-Sanchez, I., Levings, M. K. Transduction of human T cell subsets with lentivirus. Methods Mol Biol. 2285, 227-254 (2021).
  29. Bailey-Bucktrout, S. L., et al. Self-antigen-driven activation induces instability of regulatory T cells during an inflammatory autoimmune response. Immunity. 39 (5), 949-962 (2013).
  30. Nakagawa, H., et al. Instability of Helios-deficient Tregs is associated with conversion to a T-effector phenotype and enhanced antitumor immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (22), 6248-6253 (2016).
  31. Dawson, N. A. J., et al. Functional effects of chimeric antigen receptor co-receptor signaling domains in human regulatory T cells. Sci Transl Med. 12 (557), eaaz3866 (2020).
  32. Rana, J., et al. CAR- and TRuC-redirected regulatory T cells differ in capacity to control adaptive immunity to FVIII. Mol Ther. 29 (9), 2660-2676 (2021).
  33. Battaglia, M., Stabilini, A., Tresoldi, E. Expanding human T regulatory cells with the mTOR-inhibitor rapamycin. Methods Mol Biol. 821, 279-293 (2012).
  34. Brady, B. L., Steinel, N. C., Bassing, C. H. Antigen receptor allelic exclusion: an update and reappraisal. J Immunol. 185 (7), 3801-3808 (2010).
  35. Samarasinghe, S., et al. Functional characterization of alloreactive T cells identifies CD25 and CD71 as optimal targets for a clinically applicable allodepletion strategy. Blood. 115 (2), 396-407 (2010).
  36. Voss, K., et al. FOXP3 protects conventional human T cells from premature restimulation-induced cell death. Cell Mol Immunol. 18 (1), 194-205 (2021).
  37. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods Mol Biol. 707, 21-37 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены