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요약

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

초록

키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 암 치료의 양상을 바꾸어 놓았으며, 이전에는 불치의 혈액암에서 기록적인 관해율을 달성했습니다. 이러한 성공은 주로 면역 반응을 조절하고 억제하는 역할을 하는 CD4+ T 세포의 작지만 중추적인 하위 집합인 조절 T 세포(Tregs)에 CAR 플랫폼을 적응시키는 데 대한 관심을 불러일으켰습니다. Tregs의 면역억제 활성을 세포 외 표적으로 리디렉션하는 능력은 자가면역 질환, 장기 이식 거부 반응 및 이식편대숙주질환에 대한 세포 치료법을 만드는 데 엄청난 영향을 미칩니다. 여기에서는 인간 말초 혈액에서 진정한 Treg 분리, 아데노 관련 바이러스 매개 상동 유도 복구(HDR) 템플릿 전달을 사용하여 렌티바이러스 또는 CRISPR/Cas9 보조 knock-in을 사용한 인간 Tregs의 유전자 변형 및 안정적인 인간 CAR Tregs의 생체 외 확장에 대한 방법론을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 인간 CAR Treg 표현형 안정성과 체외 억제 기능에 대한 평가를 설명하며, 이를 통해 인간 CAR Tregs가 전임상 및 임상 응용 분야에서 어떻게 작용하는지에 대한 통찰력을 제공합니다.

서문

키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR) T 세포 치료법은 혈액 악성 종양 치료에 혁명을 일으켜 이전에는 치료가 불가능했던 암에서 현저하게 높은 관해율을 달성했습니다 1,2. 교모세포종 3,4,5을 치료하기 위해 CAR T 세포를 사용한 고무적인 초기 결과는 광범위한 악성 종양을 표적으로 할 수 있는 CAR 기술의 다양성과 미래 잠재력을 강조합니다. 이 분야에서 CAR의 추가 응용 분야를 탐구함에 따라 조절 T 세포(Tregs)가 유망한 세포 유형으로 부상했습니다. Tregs는 면역 항상성을 유지하고 IL-2 격리, 면역 억제 사이토카인 분비, 항원 제시 세포 조절 등 여러 메커니즘을 통해 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 6,7.

CAR 기술을 통해 Tregs는 장기 이식 거부 반응, 자가면역 질환 및 알레르기 및 천식과 같은 염증성 질환 치료에 활용될 수 있습니다 6,8,9. CAR Tregs는 면역 체계를 전체적으로 억제하고 유해한 부작용과 관련이 있는 면역억제제의 사용을 줄임으로써 환자 결과와 삶의 질을 크게 개선할 수 있습니다10,11. 전임상 모델은 CAR 기술을 Tregs로 변환하는 데 유망한 결과를 보여주었으며 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 이식편대숙주병 및 염증성 장 질환과 같은 질병에 성공적으로 적용되었습니다 9,12,13,14,15. 임상에서는 현재 고형 장기 이식 거부 반응을 예방하기 위해 CAR Tregs를 연구하고 있습니다16.

이 논문은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하기 위한 자세한 방법론을 제시합니다. 이 프로토콜은 인간 말초 혈액에서 Tregs를 분리하고 CRISPR/Cas9 유전자 편집 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 사용한 렌티바이러스 형질전환 및 정밀 유전자 넉인(knock-in)과 같은 기술을 사용하여 유전자 변형하는 것을 포함합니다. 우리는 또한 이러한 조작된 Tregs의 표현형 안정성과 억제 기능에 대한 평가를 설명하며, 이는 치료 잠재력을 검증하는 데 중요한 단계입니다 17,18,19. 이 접근 방식은 면역 체계를 조절하기 위해 CAR T 세포 요법의 혁신적인 영향을 확장할 수 있는 잠재력을 가진 CAR Treg 요법의 설계 및 조기 테스트를 간소화합니다. 우리의 방법론을 공유함으로써 급성장하고 있는 CAR Treg 치료 공간 9,20에서 추가 연구와 혁신에 영감을 줄 수 있기를 바랍니다.

프로토콜

1. 인간적인 Treg 고립

  1. Leukopak 가공
    1. 류코팩의 내용물을 50mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 피펫과 부드럽게 혼합하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) +2% 소 태아 혈청(FBS)을 동일한 부피로 추가합니다.
    2. 실온(RT)에서 300× g에서 10분 동안 회전합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 2mL의 DPBS + 2% FBS로 세포 펠렛을 재구성합니다. 피펫으로 염화암모늄 용액 8mL를 세포 현탁액에 4:1 비율로 첨가하고 완만한 반전으로 혼합한 다음 얼음 위에서 15분 동안 남은 적혈구를 용해시킵니다.
    3. RT에서 10 분 동안 300×g으로 회전합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. DPBS 30mL + 2% FBS를 첨가하여 세포를 세척합니다. 브레이크를 끈 상태에서 세척된 세포를 150×g에서 RT에서 10 분 동안 회전 시킵니다. 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 세포 펠릿을 30mL의 DPBS + 2% FBS에 재현탁합니다.
    4. 현재 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 트리판 블루가 있는 세포를 1:1 비율로 계산합니다.
      1. 세포 농도가 높기 때문에 처음에는 10μL의 세포를 DPBS로 1:100으로 희석합니다. 그런 다음 10μL의 1:100 희석된 세포를 10μL의 트리판 블루 용액과 혼합하여 최종 1:1 희석합니다. 자동 세포 계수기를 사용하는 경우, 대부분의 계수기는 2배 희석을 가정하므로 보고된 농도에 100을 곱하여 200배 희석을 반영하도록 세포 수를 수정하십시오. 1/10 leukopak에서 1-2.5 × 109 PBMC를 산출할 것으로 예상됩니다.
  2. CD4+ T 세포 분리(음성 선택)
    1. RT에서 5분 동안 500 × g에서 108-10 9 PBMC를 스핀다운하고 5 × 107 cells/mL에서 세포 분리 버퍼(DPBS + 1mM EDTA + 2% FBS)에 재현탁합니다.
      참고: 유전자 변형을 위한 충분한 human Tregs를 얻으려면 1 × 109 PBMCs로 시작하는 것이 좋습니다.
    2. CD4+ T 세포 농축 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 자기 분리를 수행합니다.
    3. 트리판 블루(10 μL 세포 + 10 μL 트리판 블루)로 계수하여 분리된 CD4+ T 세포의 양을 측정합니다.
  3. CD8+ T 세포 분리(음성 선택)
    1. RT에서 5분 동안 500 × g에서 5 × 107 PBMC를 스핀합니다. 5 × 107 cells/mL에서 세포 분리 완충액(DPBS + 1 mM EDTA + 2% FBS)에 재현탁합니다.
      참고: 2-5 × 106 CD8+ T 세포를 얻으려면 5 × 107 PBMC로 시작하는 것이 좋습니다.
    2. CD8+ T 세포 농축 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 자기 분리를 수행합니다.
    3. 트리판 블루(10 μL 세포 + 10 μL 트리판 블루)로 계수하여 분리된 CD8+ T 세포의 수를 측정합니다.
  4. Treg 형광 보조 세포 분류(FACS)
    1. 1.2단계에서 설명한 대로 CD4+ T 세포를 분리하고 다음 날 FACS를 위해 4°C에서 2% FBS와 함께 DPBS에 밤새 보관합니다(세포 수 및 생존율의 최소 손실). 트리판 블루(10μL 세포 + 10μL 트리판 블루)로 계수하여 1.2단계의 CD4+ T 세포 수를 측정합니다.
    2. CD4+ 세포를 500 × g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 200μL의 DPBS에서 세포를 재구성합니다.
    3. 1 × 106 세포당 항-인간 CD4 FITC 1 μL, 항-인간 CD25 APC 1 μL, 항-인간 CD127 PE 1 μL를 첨가합니다. 부드럽게 소용돌이치고 4°C의 어두운 냉장고에 30분 동안 넣습니다.
    4. 2% FBS가 포함된 10mL의 DPBS로 세포를 세척합니다. 500 × g 에서 5 분 동안 돌립니다. 염색된 세포를 2% FBS를 사용하여 DPBS에서 1.5 × 107 cells/mL로 부드럽게 재현탁합니다. 이는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 분류하기 위해 권장되는 세포 농도입니다.
    5. 염색된 세포 현탁액을 40μm 필터 캡을 통해 FACS 튜브에 통과시킨 다음 튜브를 얼음 위에 유지합니다.
    6. RPMI10 배지 3ml가 들어 있는 15mL 수집 튜브를 준비하고 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 이 배지는 RPMI1640 기초 배지, 10% FBS, 1x 페니실린-스트렙토마이신, 1x L-알라닐-L-글루타민, 1x 비필수 아미노산, 1x 피루브산 나트륨 및 1x HEPES로 구성됩니다.
    7. 그림 1A와 같이 FACS를 사용하여 CD4+CD25높은CD127- 조절 T 세포(Tregs) 및 CD4+CD25낮은CD127+ 기존 T 세포(Tconv)를 정렬합니다.
    8. 세포 수율 및 생존력을 측정합니다. 그런 다음 다운스트림 분석 또는 T 세포 활성화를 진행합니다.

2. T 세포 활성화

  1. 트리판 블루(10 μL + 10 μL 트리판 블루)로 분리된 T 세포를 계수합니다.
  2. 1 × 106 T 세포를 얻을 때마다 25 μL의 anti-CD3/CD28 비드(106 비드)를 세척하여 T 세포에 대한 비드 대 비드를 1:1 비율로 유지합니다. DPBS를 첨가하고, 자석에서 3분 동안 배양하고, 세포에 독성이 있을 수 있는 현재 희석된 anti-CD3/CD28 비드 버퍼를 제거하여 anti-CD3/CD28 비드를 세척합니다.
  3. 자석에서 튜브를 제거하고 세척된 비드를 RPMI10 배지에 다시 매달아 1 × 106 비드/1mL의 RPMI10을 갖도록 합니다.
  4. RPMI10 배지에서 항-CD3/CD28 비드로 T 세포를 1 × 106 T cells/mL의 농도로 재현탁합니다. 그런 다음 Treg 세포에 IL-2 1,000IU/mL, IL-2 - CD4+ Tconv 세포 100IU/mL, CD8+ T 세포에 IL-2 300IU/mL를 추가합니다.
  5. 24웰 플레이트의 웰당 1 × 106 개 세포에서 서로 다른 양의 anti-CD3/CD28 비드와 IL-2를 사용하여 T 세포를 배양합니다. 24웰 플레이트를 37°C, 5% CO2 조직 배양 인큐베이터에 놓습니다.
  6. 실험에 사용되거나 추가 확장을 위해 anti-CD3/CD28 beads로 재활성화될 때까지 IL-2가 있는 상태에서 9-12일 동안 활성화된 T 세포를 확장합니다. 2-3일마다 배지를 교체하고 새 배지가 추가될 때마다 IL-2를 추가합니다. Tregs의 세포 밀도를 세포를 계수하거나 분할 전에 육안 검사를 통해 확장하는 동안 mL당 5 ×10 5 to 1 × 106 cells로 유지합니다.

3. 인간적인 Treg lentiviral transduction

  1. 활성화 후 48시간 후에 Tregs를 다시 일시 중단하고 계산합니다. RT에서 5분 동안 500×g 으로 회전합니다. 1,000 IU/mL의 IL-2로 1.25 × 106 cells/mL에서 RPMI10의 Tregs를 재현탁합니다.
  2. 원심분리기를 32°C로 예열합니다.
  3. 렌티바이러스가 함유된 CAR 구조체를 얼음 위에서 해동합니다.
    참고: 당사는 -80 °C에서 1의 MOI로 2.5 × 105 세포를 형질도입하기에 충분한 렌티바이러스가 포함된 일회용 렌티바이러스 분취액을 보관합니다.
  4. 마이크로 원심분리 튜브에서 200 μL × 2.510 5 Tregs에 각 렌티바이러스 분취액을 첨가하면 각 튜브는 반응을 나타냅니다. 32°C에서 1 시간 동안 1,000×g에서 spinoculate합니다.
  5. 각 200μL 반응을 24웰 플레이트로 이동합니다. 미디어가 전체 우물을 덮는지 확인하십시오. 조직 배양 인큐베이터에서 형질도입된 Tregs와 함께 24웰 플레이트를 하룻밤(16-18시간) 배양합니다. 최종 IL-2 농도가 1,000IU/mL인 RPMI10 배지로 각 웰을 2mL로 보충합니다.
  6. 세포를 분리하고 필요에 따라(2-3일마다) 미리 예열된 새로운 RPMI10 및 IL-2를 보충하여 활성화 후 9-12일 후에 형질도입된 Tregs를 계속 확장하십시오. 이상적인 세포 농도는 5 × 105-1 × 106 cells/mL입니다.
  7. 그림 2와 같이 유세포 분석을 사용하여 유전자 변형 효율을 평가합니다.
    참고: 당사의 렌티바이러스 CAR 구조체는 CAR 유전자의 N-말단에 Myc-tag와 2A 펩타이드에 의해 CAR 유전자에 연결된 GFP 리포터 유전자를 포함하고 있어 항체 염색(GFP) 없이 transduction efficiency를 정량화하고 CAR 표면 발현(Myc-tag)을 확인할 수 있습니다. transduction 5일 후 유전자 변형 효율을 평가합니다. 형질 전환 효율은 공여체와 사용된 CAR 구조체에 따라 30%에서 70% 사이로 다양할 수 있습니다. 원하는 경우 CAR+ 셀을 정렬할 수 있습니다.
  8. 변형된 Tregs가 활성화 주기(9-12일)를 완료하고 IL-2가 없는 상태에서 실험에 사용하기 전에 24시간 동안 휴식을 취해야 합니다.

4. 인간적인 Tregs에 있는 CRISPR/Cas9 매개 유전자 knock-in

  1. Tregs를 재현탁하고 활성화 48시간 후 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 자석에 3분 동안 배양합니다.
  2. 자석에 있는 동안 피펫을 통해 배지의 세포를 새 튜브로 옮깁니다. anti-CD3/CD28 비드는 튜브 벽에 부착된 상태로 유지됩니다. 비드 제거 후 2시간 동안 디비드된 Tregs를 RPMI10에 그대로 두어 디비드의 즉각적인 스트레스를 회복하고 향후 transduction 효율과 electroporation의 회복을 향상시킵니다.
  3. 트리판 블루로 비즈가 제거된 Tregs를 세십시오.
  4. FBS가 없는 환원 혈청 배지를 37°C로 예열합니다.
  5. 항생제(페니실린-스트렙토마이신)가 없는 RPMI10 배지 2.5mL와 웰당 IL-2 1,000IU/mL가 포함된 6웰 플레이트를 준비합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 37°C로 예열합니다.
  6. 아데노 관련 바이러스(AAV)를 함유한 CAR 상동성 유도 복구(HDR) 템플릿을 얼음 위에서 해동합니다.
    참고: 당사는 -80 °C에서 20,000의 MOI로 4 × 106 세포를 감염시키기에 충분한 AAV가 있는 일회용 부분 표본을 보관합니다.
  7. 500 × g 에서 5 분 동안 Tregs를 돌립니다. 상층액을 디캔팅한 후 예열된 환원 혈청 배지에서 4 × 107 cells/mL로 세포를 재현탁합니다.
  8. 단백질 결합이 낮은 1.5mL 원심분리 튜브의 100μL의 부분 표본 세포. MOI 20,000에서 CAR AAV를 각 샘플에 추가하고 재현탁합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 반응 튜브를 1시간 동안 배양합니다.
  9. 1시간 배양 중에 Cas9 대 sgRNA 1:1의 몰비와 샘플당 총 RNP 부피 10.8μL를 위해 TRAC 유전자 자리(100μM 스톡)를 대상으로 하는 2.5μL의 sgRNA에 8.3μL의 Cas9 단백질(1mg/mL 스톡)을 천천히 첨가하여 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체를 준비하고 조립합니다. 위아래로 부드럽게 피펫을 넣어 섞습니다. 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 15분 동안 RNP 혼합물을 배양합니다.
    참고: RNP 복합체는 나중에 사용할 준비가 될 때까지 RT에 남아 있을 수 있습니다.
  10. 새 electroporation tube(E 튜브)에 3mL의 고삼투압 electroporation buffer를 채웁니다. 딸깍 소리가 날 때까지 채워진 E 튜브를 전기천공 시스템의 피펫 스테이션에 삽입합니다. electroporation 시스템에서 electroporation 조건을 2,200V, 20ms, 1pulse 로 설정합니다.
  11. AAV를 사용한 1시간 배양이 완료되면 RT에서 5분 동안 300 × g 에서 AAV로 세포를 회전시킵니다. 상등액을 조심스럽게 흡입하고 샘플당 전기천공법 시스템에서 제공하는 세포 재현탁액 100μL에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
    참고: 신속하게 작업하고 버퍼에 셀을 15분 이상 두지 마십시오. 거품을 만들지 마십시오.
  12. 샘플당 10.8μL의 RNP 복합체를 추가합니다. 거품을 만들지 않고 피펫으로 잘 섞습니다.
  13. 피펫을 두 번째 스톱으로 밀어 클램프를 열어 100μL 전기천공레이션 팁을 삽입합니다. 클램프가 피스톤의 장착 스템과 단단히 맞물릴 때까지 피펫의 상단 헤드를 전기천공 팁에 배치합니다. 팁이 틈 없이 꼭 맞도록 피펫에 대한 아래쪽 압력을 유지하면서 버튼을 서서히 놓습니다.
  14. 피펫을 첫 번째 스톱까지 누르고 전기천공법 팁을 cell-RNP 혼합물에 담그십시오. 기포 없이 샘플을 피펫으로 부드럽게 당겨 넣습니다.
    알림: electroporation 동안 팁 내부에 기포가 존재할 수 없습니다.
  15. 딸깍 소리가 들릴 때까지 샘플이 들어있는 electroporation 팁이 장착된 피펫을 E 튜브에 수직으로 삽입합니다.기포가 생성되지 않도록 합니다.
  16. human Tregs에 대한 최적 설정(2,200 V, 20 ms, 1 Pulse)이 입력되었는지 확인하고 터치스크린에서 start 를 눌러 세포를 전기천공합니다.
  17. electroporation이 완료되면 터치스크린에 Complete(완료 )가 표시될 때까지 기다립니다. 피펫을 부드럽게 제거하고 웰당 1,000IU/mL의 IL-2가 포함된 2.5mL의 예열된 무항생제 RPMI10 배지가 들어 있는 준비된 6웰 플레이트로 샘플을 즉시 옮깁니다. 나머지 샘플에 대해 반복합니다. 플레이트를 직선 동작(왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로)으로 부드럽게 흔들어 각 웰에 세포가 고르게 분포되도록 하고 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: electroporation tip의 재사용은 동일한 세포와 RNP 복합체를 사용하는 경우 최대 3배까지 허용됩니다. 세포를 세거나 원하는 경우 HDR 인핸서를 추가하는 것과 같은 방식으로 세포를 방해하기 전에 30분의 회복 기간을 허용합니다.
  18. 다음 날, 16-18시간 후, 배지를 항생제 함유 배지로 교체하고, 전기천공된 Tregs를 트리판 블루로 계수하고, 1,000 IU/mL IL-2로 106 cells/mL에서 배양합니다. 2.6단계에서 설명한 대로 세포를 분할하고 새로운 RPMI10 및 IL-2를 보충하여 전기천공된 Treg를 계속 확장합니다.
  19. 유세포 분석법을 통한 분석을 위해 시료를 얼음 위에 보관하십시오.
    1. 단색 보정 컨트롤을 설정하고 실험 파일에 적용합니다.
    2. 먼저 염색되지 않은 샘플을 판독하여 FSC 및 SSC 증가를 조정하여 림프구 집단이 'All events' 점도표의 중간에 있도록 합니다.
    3. 그림 3C와 같이 림프구를 비파편으로/단일 세포를 생존 가능한 세포로 CD4+ 세포로 게이팅 전략을 설정합니다.
  20. 유세포 분석을 사용하여 유전자 변형 효율을 평가합니다.
    참고: 당사의 AAV CAR 구조체는 TRAC 유전자 좌위 상동성 arm 외에도 그림 3과 같이 2A 펩타이드에 의해 CAR 유전자에 연결된 절단된 표피 성장 인자 수용체(EGFRt) 리포터 유전자를 포함합니다. 유전자 knock-in 효율은 CD3에 대한 표면 염색에 의해 결정되며, CD3의 손실은 TCR 표면 발현의 손실을 나타내므로 CRISPR/Cas9 및 EGFRt를 사용한 TRAC 유전자 자리의 성공적인 표적화를 나타내며, EGFRt의 발현은 CAR 전이유전자의 성공적인 통합을 나타냅니다. CAR knock-in Tregs는 CD3-EGFRt+ 세포입니다. 전기천공법 5일 후 유전자 변형 효율을 평가합니다.
  21. 변형된 Tregs가 활성화 주기(9-12일)를 완료하고 IL-2가 없는 상태에서 24시간 동안 휴식을 취한 후 실험에 사용되는지 확인합니다.

5. 인간적인 CAR Treg 활성화

  1. 공동 문화 설정(Day 0)
    1. CAR 항원 발현 표적 세포주를 원뿔형 튜브에 모읍니다.
      참고: HLA, CD80 및 CD86 발현이 부족한 인간 골수성 백혈병 세포주인 K562 세포를 CAR Treg 활성화를 위한 표적 세포로 사용합니다. 부모 K562 세포는 음성 대조군으로 사용되며 CAR 항원 발현 K562는 CAR Tregs17,21을 활성화하는 데 사용됩니다.
    2. Cesium-137 또는 X-ray 방사선 조사기에 4,000 rad 의 표적 세포주를 조사합니다. 조사기에 접근할 수 없는 경우, 미토마이신 C 치료를 수행하여 세포 증식을 멈추면서 표적 세포에서 표면 항원 발현을 유지한다22.
    3. 아직 수행하지 않은 경우 anti-CD3/CD28 비드에 결합된 Tregs를 재현탁하고 15mL 코니컬 튜브로 옮겨 Tregs를 디비드합니다. 세포 현탁액을 자석에 3-5분 동안 배양합니다. 자석에 있는 동안 피펫을 통해 배지의 세포를 새 튜브로 옮깁니다. 안티-CD3/CD28 비드는 튜브 벽에 부착된 상태로 유지됩니다.
    4. 방사선 조사된 표적 세포와 탈비드된 CAR Treg 농도를 trypan blue로 측정합니다.
    5. 방사선 조사된 표적 세포와 CAR Tregs를 500 × g 에서 5분 동안 스핀합니다. 예열된 RPMI10을 별도의 튜브에 106 cells/mL로 재현탁합니다. 2,000 IU/mL의 농도를 위해 CAR Tregs에 IL-2를 첨가합니다.
      참고: 이 양의 IL-2는 CAR Tregs가 1,000IU/mL의 최종 IL-2 농도를 위해 대상 세포와 결합되면 2배로 희석됩니다.
    6. 1 ×× 105(100 μL) CAR 항원 음성, 방사선 조사 표적 세포(활성화를 위한 음성 대조군), 1 ×10 5(100 μL) CAR 항원 양성, 방사선 조사 표적 세포(실험) 또는 2.5 μL의 항-CD3/CD28 비드(활성화를 위한 양성 대조군) 및 97.5 μL의 RPMI10 배지를 96웰 원형 바닥 플레이트에서 공동 배양합니다. 플레이트를 37°C, 5% CO2 조직 배양 인큐베이터에 48시간 동안 놓습니다.
      참고: 웰당 최종 부피는 200μL입니다. 각 조건에 3개의 반복실험이 있는지 확인합니다.
  2. 유세포 분석 판독
    1. 플레이트 리더를 사용하지 않는 한, 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 각 웰의 내용물을 다시 매달아 FACS 튜브로 옮깁니다. 500 x g에서 5분 동안 회전합니다. 상층액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 부드럽게 와류로 만듭니다.
    2. 유세포 분석 항체 마스터 믹스 준비: DPBS, 항인간 CD4 PE/Cy7 1:200, 항인간 CD71 PE 1:100 및 Ghost Viability Dye BV510 1:2000을 포함하는 100μL/샘플.
      참고: 이 패널은 CAR 리포터 유전자가 GFP인 경우 잘 작동합니다. 리포터 유전자가 EGFRt와 같은 항체 염색이 필요한 표면 단백질을 암호화하는 경우, 예를 들어 FITC-접합 항체를 사용할 수 있습니다.
    3. 100 μL의 항체 마스터 혼합물을 각 샘플에 피펫으로 주입하고, 부드럽게 혼합한 후 4°C 냉장고에서 30분 동안 배양합니다.
    4. 500 × g 에서 5분 동안 회전하여 500μL의 DPBS로 세척합니다. 세포 펠릿을 200μL의 DPBS에 재현탁합니다.
    5. 유세포 분석법을 통한 분석을 위해 시료를 얼음 위에 보관하십시오.
      1. 단색 보정 컨트롤을 설정하고 실험 흐름 파일에 적용합니다.
      2. 염색되지 않은 샘플을 판독하여 SSC 및 FSC 증가를 조정하여 림프구 집단이 'All events' 점도표의 중간에 있도록 합니다.
      3. 그림 3C와 같이 림프구를 비파편으로/단일 세포를 생존 세포에서 CD4+ 세포로 게이팅 전략을 설정합니다(다양한 형광단 사용).
      4. 약 1,500 events/s의 이벤트 속도로 샘플을 판독하여 Treg 활성화를 평가합니다.
        참고: 예상되는 결과는 그림 4와 같이 CAR 항원이 있는 경우 CAR Tregs에서 CD71 표면 발현의 상향 조절입니다. CAR 항원이 있는 상태에서 상향 조절이 보이지 않으면 강장제 신호가 존재할 수 있습니다.

6. 인간적인 CAR Treg 안정성

  1. 공동 문화 설정 및 확장(0-9일차)
    1. 5.1단계에 설명된 대로 CAR Tregs를 활성화하도록 공동 배양을 설정합니다.
    2. 48시간 후, 각 96웰 라운드 바닥 플레이트 웰에서 세포 증식을 허용하기 위해 1,000IU/mL IL-2로 예열된 2mL의 RPMI10이 포함된 24웰 플레이트 웰로 공동 배양을 이동합니다.
    3. 1,000 IU/mL IL-2와 함께 예열된 새 RPMI10을 추가하고 필요에 따라 추가 24웰 플레이트로 분할합니다.
  2. 유세포 분석 판독
    1. 각 복제물의 내용물을 15mL 또는 50mL 코니컬 튜브로 재현탁하고 옮깁니다. 세포 농도를 측정합니다.
    2. 각 복제에 대해 5 × 105 및 1 × 106 세포 사이를 FACS 튜브로 이동합니다. 500 ×g에서 5 분 동안 돌립니다 .
    3. 표면 염색을 위한 유세포 분석 항체 마스터 믹스 준비: DPBS, anti-human CD4 PE/Cy7 1:200, anti-human CD25 APC 1:200 및 Ghost Viability Dye BV510 1:2000을 포함하는 100μL/샘플. 필요한 경우 CAR 리포터 단백질에 대한 FITC 접합 항체를 포함합니다.
    4. 6.2.2 단계에서 상등액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 부드럽게 와류로 만듭니다. 각 FACS 튜브에 100 μL의 표면 염색 항체 마스터 믹스를 피펫팅합니다. 잠시 소용돌이치고 4 ° C 냉장고에 30 분 동안 어둠 속에서 두십시오.
    5. transcription factor staining buffer set를 사용하여 Fixation/Permeabilization 농축액 1량에 Fixation/Permeabilization 희석제 3량을 추가하여 Fixation/Permeabilization buffer를 준비합니다. 각 샘플에는 100μL의 고정/투과 완충액이 필요합니다.
    6. 표면 염색된 세포를 500μL의 DPBS로 세척합니다. 500 × g 에서 5 분 동안 회전하고 상층액을 디캔팅합니다. 준비된 100 μL의 고정/투과 완충액을 각 튜브에 피펫팅합니다. 잠시 소용돌이치고 어둠 속에서 30-60분 동안 4°C에서 고정이 발생하도록 합니다.
    7. 전사 인자 염색 완충액 세트를 사용하여 1부피의 Permeabilization Buffer 10x 농축액에 9부피의 증류수를 첨가하여 1x 투과화 완충액을 준비합니다. 각 샘플은 세척을 위해 1,000μL의 투과화 완충액이 필요하고 세포 내 단백질을 표적으로 하는 항체로 염색하기 위해 100μL의 투과화 완충액이 필요합니다.
    8. 500 μL의 1x 투과화 완충액을 첨가하여 고정/투과화된 세포를 세척합니다. RT에서 5분 동안 500× g 으로 회전합니다.
    9. 1x Permeabilization buffer, anti-human FOXP3 eFluor 450 1:50, anti-human HELIOS PE 1:50 및 anti-human CTLA-4 PerCP-e710 1:50을 사용하여 세포 내 염색 항체 마스터 믹스를 준비합니다. 각 샘플에는 100μL의 항체 마스터 믹스가 필요합니다.
      참고: 이 패널은 CAR 리포터 유전자가 GFP이거나 CAR 리포터 단백질(예: EGFRt)이 FITC 접합 항체로 염색된 경우에 작동합니다.
    10. 6.2.8 단계에서 상등액을 디캔팅합니다. 세포 내 염색 항체 마스터 믹스 100μL를 추가하고 잠시 와류를 일으킨 다음 어둠 속에서 30분 동안 RT에서 배양합니다.
    11. 500 μL의 1x 투과화 완충액을 첨가하여 염색된 고정/투과성 세포를 세척합니다. 500 × g 에서 5 분 동안 회전합니다. 상등액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 300μL의 DPBS에 재현탁시킨 후 얼음 위에 보관합니다.
    12. 그림 5와 같이 유세포 분석으로 분석합니다. 예상 결과는 대부분의 CAR Tregs가 FOXP3+HELIOS+ 셀이 될 것이라는 것입니다. CD4+ Tconv 세포를 FOXP3 및 HELIOS 염색에 대한 음성 대조군으로 사용합니다.

7. 인간적인 CAR Treg 억제

  1. Responder T cell (Tresp) 세포 미량 염료 염색 및 하룻밤 활성화
    1. 확장된 CAR Treg 세포, 새로 분리된 CD4+ Tconv 세포 및 새로 분리된 CD8+ T 세포를 별도의 15mL 코니컬 튜브에 수집하고 아직 제거하지 않은 경우 anti-CD3/CD28 bead를 디비드합니다.
    2. 5.1단계에서 설명한 대로 조사된 CAR 항원 발현 표적 세포를 준비합니다.
    3. 활성화되지 않은 T 세포 및 방사선 조사된 표적 세포 농도를 측정합니다.
    4. 5 × 106 CD4+ Tconv 세포를 5 × 106 CD8+ T 세포(1:1 비율)와 결합합니다. 이들은 분석에서 CAR Tregs에 의해 억제되는 반응 T 세포(Tresp) 입니다. RT에서 5분 동안 500× g 의 Tresp 세포를 스핀합니다. 상등액을 조심스럽게 흡인하고 Tresp 세포를 DPBS 1mL에 재현탁합니다.
    5. DMSO에서 재구성된 5mM CellTrace Violet(CTV) 염료 1mL를 DPBS 1mL의 7Tresp 세포 10개에 첨가하여 최종 농도를 5μM CTV로 만듭니다. 37°C의 수조에 20분 동안 넣습니다. 10분에서 부드럽게 소용돌이치며 침전된 CTV를 재분배합니다.
    6. 예열된 RPMI10 완전 배지 9mL로 세척합니다. 500 × g 에서 5 분 동안 회전합니다. 예열된 RPMI10 완전 배지 5mL에 재현탁합니다.
    7. CTV 표지 Tresp 세포 농도를 측정합니다. 최소 증식 제어로 96웰 라운드 바닥 플레이트의 3-6웰에 있는 200μL의 RPMI10 배지에 5 × 104 CTV 표지 된 비활성화 Tresp 세포를 추가합니다.
    8. RPM10 배지에서 IL-2가 없는 1:10 비드 대 Tresp 세포 비율 로 anti-CD3/CD28 beads로 CTV 표지 Tresp 세포를 활성화합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 24웰 플레이트의 웰당 1mL의 RPMI10 배지에 10개의6 CTV 표지 Tresp 세포를 하룻밤 동안 분주합니다.
    9. 동시에 106 CAR+ Tregs를 얻습니다. 이 금액은 96웰 라운드 바텀 플레이트 웰당 5 × 104 타겟 셀에서 5 × 104 × 3 + 2.5 × 104 × 3 + 1.25 × 104 × 3 + 0.625 × 104 × 3 = 2.81 × 105 CAR Tregs의 4개 CAR Treg 활성화 조건: 방사선 조사된 CAR 항원 음성 타겟 세포(음성 대조군, no activation) 및 방사선 조사된 CAR 항원 양성 표적 세포(실험, CAR 활성화)를 조사했습니다.
    10. 3 × 105 CAR Tregs를 2개의 별도 15 mL 원뿔형 튜브에 3 × 105 조사된 CAR 항원 음성 세포(1:1 비율) 및 3 ×× 105 CAR 항원 양성 표적 세포(1:1 비율)와 결합하고 500 × g에서 RT에서 5분 동안 회전합니다. 상등액을 조심스럽게 흡인합니다.
    11. 7.1.10단계에서 각 튜브의 펠릿을 예열된 RPMI10 배지 600μL에 재현탁합니다. 그 결과 1:1 Treg: Tresp 3회 각각에 대해 200μL가 생성됩니다. 다음과 같이 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 연속 희석을 수행합니다.
      1. 준비된 600μL의 Treg + 타겟 세포 현탁액에서 200μL의 세포 현탁액을 3개의 1:1 비율 웰 각각에 피펫으로 주입합니다.
      2. 예열된 RPMI10 완전 배지 100μL를 빈 1:2, 1:4 및 1:8 비율 웰 각각에 추가합니다.
      3. 각 삼중주에 대해 1:1 웰에서 관련 1:2 비율 웰로 세포 현탁액 100μL를 피펫팅합니다.
      4. 각 트리플리케이트에 대해 1:2 웰에서 관련 1:4 비율 웰로 세포 현탁액의 100μL를 피펫팅합니다.
      5. 각 트리플리케이트에 대해 1:4 웰에서 관련 1:8 비율 웰로 세포 현탁액의 100μL를 피펫팅합니다.
      6. 1:8 비율 웰에서 남은 100μL의 세포 현탁액을 폐기물 용기에 피펫팅합니다.
        참고: 각 웰에는 5 ×10 4 (1:1), 2.5 × 104 (1:2), 1.25 × 104 (1:4) 또는 0.625 × 104 (1:8) CAR Tregs와 동일한 수의 방사선 조사된 표적 세포가 있는 100μL의 세포 현탁액이 포함되어야 합니다.
  2. CAR Treg 및 Tresp 세포 공동 배양
    1. 활성화 후 16-18시간 후, 24웰 플레이트에서 활성화된 Tresp 세포를 원뿔형 튜브로 수집하고 자석을 통해 anti-CD3/CD28 비드를 제거합니다.
    2. 디비드된 CTV 표지 Tresp 세포 수를 측정합니다.
    3. 세척하고 2 × 106 Tresp 세포를 500 × g 에서 5 분 동안 탈수합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 4mL의 RPMI10 완전 배지에 세포를 재현탁합니다.
    4. 최대 증식 제어를 위해 CAR Tregs를 사용하여 각 웰에 100μL의 T 세포 현탁액(5개 × 10개의4T 세포)을 추가하고, 100μL의 RPMI10 배지만 있는 3-6개의 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C, 5% CO2 조직 배양 인큐베이터에 72시간 동안 놓습니다.
      참고: 96웰 둥근 바닥 플레이트에는 이제 활성화되지 않은 Tresp 세포만 있는 3-6개의 웰(최소 증식 제어), 활성화된 Tresp 세포만 있는 3-6개의 웰(최대 증식 제어) 및 CAR Tregs의 수가 감소하는 동안 활성화된 Tresp 세포가 있습니다.
  3. 유세포 분석 판독
    1. 각 96웰 원형 바닥 플레이트의 내용물을 재현탁하고 라벨이 부착된 FACS 튜브로 옮깁니다. 또는 플레이트 판독 모드가 있는 유세포 분석기를 사용할 수 있는 경우 96-well V-bottom 플레이트로 옮깁니다. 500 × g 에서 5 분 동안 회전합니다.
    2. 그 동안 DPBS, anti-human CD4 PE/Cy7 1:200 및 anti-human CD8 PerCP 1:200이 포함된 항체 마스터 믹스를 준비합니다. 각 샘플에는 100μL의 항체 마스터 믹스가 필요합니다.
    3. 세포 펠릿을 부드럽게 와류로 만듭니다. 각 FACS 튜브에 100μL의 항체 마스터 믹스를 피펫으로 주입합니다. 잠시 소용돌이치고 어둠 속에서 30분 동안 4°C에서 배양합니다.
    4. 500μL의 DPBS로 세척합니다. 96웰 V-바닥을 사용하는 경우 100μL의 DPBS로 2x 세척합니다. 500 × g 에서 5 분 동안 회전합니다. 상층액을 디캔팅하고 세포 펠릿을 200μL의 DPBS에 재현탁시킨 다음 어두운 곳에서 얼음 위에 튜브를 보관합니다.
    5. 그림 6과 같이 유세포 분석으로 분석합니다. 예상되는 결과는 균일하고 높은 CTV 형광 피크를 나타내기 위해 비활성화 Tresp 세포 단독으로(최소 증식), 각 세포 분열(최대 증식)에 해당하는 CTV 강도의 여러 피크를 표시하는 활성화된 Tresp 세포단독으로, CTV 피크의 수와 높이의 감소를 나타내는 활성화된 CAR Tregs가 있는 상태에서 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 따라서 확산됩니다.
    6. Treg 세포 매개 억제를 다음과 같이 계산합니다.
      figure-protocol-18508
      참고: FlowJo 소프트웨어를 사용하는 경우 세포 증식 모델링을 사용하여 각 샘플에 대한 분할 지수(DI)를 계산하고 위 공식에서 증식 세포의 백분율 대신 DI를 사용하여 억제 백분율을 계산할 수도 있습니다.

결과

여기에 설명된 프로토콜은 자가면역 질환, 이식편대숙주질환, 장기 이식 거부 반응 및 알레르기에 대한 살아있는 치료제를 만드는 것을 목표로 인간 조절 T 세포(Tregs)에서 새로운 키메라 항원 수용체(CAR) 구조를 평가하기 위한 간소화되고 표준화된 파이프라인을 제공합니다. 그림 1은 생체 외 확장 후 Treg 계통 전사 인자 FOXP3 및 HELIOS의 높은 ?...

토론

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 평가하기 위한 간소화되고 포괄적인 방법론을 제공합니다. 혈액암 치료에 대한 CAR 기술의 성공은 T 세포의 면역 억제 하위 집합인 Tregs에 적용되도록 영감을 주었습니다. 기존 T 세포와 달리 Tregs는 면역 반응을 억제하여 자가면역 질환, 장기 이식 거부 반응, 이식편대숙주병, 알레르기와 같은 원치 ?...

공개

LMRF는 발명자이며 조작된 면역 세포에 대한 특허로 로열티를 받았으며 Guidepoint Global 및 McKesson에 컨설팅을 제공하고 있습니다. 나머지 저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

LMRF는 HIRN(Human Islet Research Network) Emerging Leader in Type 1 Diabetes Grant U24DK104162-07, ACS(American Cancer Society) Institutional Research Grant IRG-19-137-20, South Carolina Clinical and Translational Research(SCTR) 파일럿 프로젝트 Discovery Grant 1TL1TR001451-01, DRC(Diabetes Research Connection) Grant IPF 22-1224 및 Swim Across America Grant 23-1579의 지원을 받습니다. RWC는 세포, 생화학 및 분자 과학 교육 보조금 T32GM132055 and Hollings Cancer Center Lowvelo Graduate Fellowship의 지원을 받습니다. 이 연구는 사우스캐롤라이나 의과대학 Hollings Cancer Center의 유세포 분석 및 세포 분류 공유 리소스(P30 CA138313)의 일부 지원을 받았습니다. CAR 돌연변이 플라스미드를 선물해 주신 UCSF(University of California, San Francisco)의 Qizhi Tang 박사에게 특별한 감사를 드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Adeno-associated virus (AAV)Charles River Laboratories
CAR target-expressing K562 cellse.g., CD19-K562
Cesium-137 irradiator
Anti-human CD8 PerCP (clone SK1)Biolegend344708
Anti-human CD4 PE/Cy7 (clone SK3)Biolegend344612
DynaMag-15 magnetThermoFisher12301D
Ghost BV510 viability dye TONBO13-0870-T100
K562 cellsAmerican Type Culture CollectionCCL-243
0.5 M EDTA, pH 8.0Gibco 15575020
1 M HEPESGibco15630080
Ammonium chloride solutionSTEMCELL Technologies7850
Anti-human CD127 PE (clone hIL-7R-M21)BD Biosciences557938
Anti-human CD25 APC (clone BC96)Biolegend 302610
Anti-human CD4 FITC (clone SK3)Biolegend 344604
Anti-human CD71 PE (clone SK1)Biolegend334106
Anti-human CD8 PerCP (clone SK1)Biolegend 344707
Anti-human CTLA-4 PerCP-e710ThermoFisher46-1529-42
Anti-human EGFR APC (clone AY13)Biolegend352905
Anti-human FOXP3 eFluor 450ThermoFisher48-4776-42
Anti-human HELIOS PEBiolegend137216
Ca2+ and Mg2+ free Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Gibco14190144
Cell counter (TC20 Automated Cell Counter)Bio-Rad1450102
Cell Counting SlidesBio-Rad1450016
CellTrace Violet Cell Proliferation KitThermoFisherC34571
DNA LoBind TubesEppendorf22431021
Easy 50 EasySep magnet STEMCELL Technologies18002
EasySep Human CD4+ T cell Enrichment KitSTEMCELL Technologies19052
EasySep Human CD8+ T cell Enrichment KitSTEMCELL Technologies19053
EasySep magnet STEMCELL Technologies18000
eBioscience Foxp3 transcription factor staining buffer setThermoFisher00-5523-00
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mLFisher Scientific08-771-2340μm
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26140079
Flow cytometerBeckman CoulterCytoFLEX LX U3-V5-B3-Y5-R3-I2
Fluorescence-activated cell sorterBD BiosciencesFACS Aria III Cell Sorter
GlutaMAXGibco35050061
Human CD3/28 T Cell Expansion and Activation DynabeadsGibco11131D
Invitrogen Neon Transfection SystemThermoFisher10431915
Invitrogen Neon Transfection System 100 μL KitThermoFisher10114334
LentivirusVectorBuilder
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco11140050
Myc Tag antibody A647 (clone 9B11)Cell Signaling Technologies2233S
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermoFisher31985062
Penicilin-Streptomycin solutionGibco15140122
Recombinant human interleukin-2 (rhIL-2)Peprotech200-02
RPMI 1640 medium, no glutamine Gibco11875093
Sodium pyruvateGibco11360070
Spectral Flow CytometerCytekNorthern Lights
TRAC gRNASynthegoSequence (CAGGGTTCTGGATATCTGT)
TrueCut Cas9 Protein v2ThermoFisherA36496
Trypan Blue solution Sigma T8154-100ML
1/10 LeukopakSTEMCELL Technologies200-00921-2 billion PBMC

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