Этот метод важен, потому что органоиды, полученные от пациента, обеспечивают быстрый и мощный инструмент для изучения урологических раковых заболеваний, поскольку они часто имитируют генетическую и фенотипическую гетерогенность этого многоспектрального заболевания. Органоиды могут быть выделены из ограниченного количества биопсийного материала пациента и могут быть быстро расширены для последующего анализа. Органоиды, полученные с использованием этого протокола, могут быть использованы как в качестве моделей, чтобы помочь нам понять клеточную и молекулярную основу урологического рака, так и в качестве инструментов прецизионной медицины, позволяющих нам предсказать, на какие методы лечения и отдельных пациентов рак может реагировать.
Для начала соберите свежий макроскопически жизнеспособный образец опухоли после операции и убедитесь, что образец погружен в транспортную среду в стерильную коническую трубку размером 50 миллилитров или банку с образцом мочи во время транзита. Запишите детали образца, включая вес ткани, описание образца и сведения о любых образцах крови и мочи на листе обработки образцов пациента. Осторожно замените транспортную среду 10 миллилитрами базальной среды и дайте опухолевой ткани осесть под действием силы тяжести.
Далее с помощью щипцов удаляют опухолевую ткань и помещают ее в стерильную 90-миллиметровую чашку Петри. Запишите вес ткани в граммах или миллиграммах на листе обработки клинического образца и сетке рассечения. Затем с помощью стерильных щипцов в одноразовом лезвии скальпеля, прикрепленного к рукоятке скальпеля, удаляют не раковую ткань и макроскопически видимые некротические области.
Промыть кусочки опухоли один или два раза холодным DPBS, затем собрать и перенести их в новую стерильную 90-миллиметровую чашку Петри. Сделайте фотографию, нарисуйте схему тканей и спланируйте рассечение ткани на сетке клинической обработки. Для гистопатологического анализа поместите примерно 50 миллиграммов опухолевой ткани в меченую одноразовую пластиковую гистологическую кассету.
Затем погрузите гистологическую кассету в контейнер с объемом от 5X до 10X 10% нейтрального буферизованного формалина и инкубируйте в течение ночи. На следующий день замените формалин 70% этанолом для хранения при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока ткань не будет обработана. Для молекулярного анализа заморозьте по меньшей мере один кусок опухоли в РНКазе, свободной от ДНКазы 1,5 миллилитра криовиала с использованием жидкого азота и храните при минус 80 градусах Цельсия.
Далее дозируют пять миллилитров органоидной среды в 90-миллиметровую чашку Петри, содержащую оставшиеся кусочки опухоли, и механически измельчают ткань как можно тоньше. с помощью стерильного лезвия скальпеля No 10. Переложите мелко измельченную ткань в коническую трубку объемом 50 миллилитров и добавьте четыре миллилитра органоидной среды, один миллилитр 10X коллагеназы/ гиалуронидазы и 0,1 миллиграмма на миллилитр ДНКазы I, чтобы избежать слипания клеток.
Инкубируют измельченную опухолевую ткань в растворе фермента в течение одного-двух часов на орбитальном шейкере или ротаторе в инкубаторе для диссоциации фрагментов в клеточную суспензию и разрушения коллагенов. Затем остановите пищеварение, добавив в образец вдвое больший объем базальной среды. Центрифугируйте образец, аспирируйте и выбросьте супернатант.
Затем, чтобы лизировать загрязняющие эритроциты, повторно суспендировать гранулу в пяти миллилитрах калиевого буфера хлорида аммония и инкубировать трубку при комнатной температуре в течение трех минут или до тех пор, пока не будет замечен полный лизис красных кровяных телец. Затем добавьте в трубку 20 миллилитров базальной среды. Снова центрифугируйте и аспирируйте супернатант.
На этом этапе поместите 10-миллилитровую аликвоту органоидной среды 2X и 1X в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия для нагревания. Сначала отфильтруйте образец через предварительно влажный обратимый 100-микронный сетчатый фильтр в новую 50-миллилитровую трубку для удаления крупного нерастворимого материала. Затем фильтруйте элют через предварительно влажный обратимый 37-микронный сетчатый фильтр для сбора отдельных клеток в небольшие кластеры для изоляции одиночных клеток и иммунных клеток.
Затем переверните 37-микронный сетчатый фильтр и добавьте 10 миллилитров базальных сред для сбора небольших и средних кластеров. Доливайте каждую из этих новых 50-миллилитровых трубок DPBS до 40 миллилитров, затем центрифугируйте суспензию и выбрасывайте супернатант. Затем добавьте 10 миллилитров базальной среды в трубку, содержащую одиночные клетки, и подсчитайте клетки, используя краситель для исключения трипанового синего цвета в автоматизированном счетчике клеток.
Определите количество клеток и жизнеспособность клеток. Центрифугируют оставшийся образец и заменяют среду раствором клеточной заморозки или базальной средой, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 1%пенициллина и стрептомицина и 10% ДМСО, затем помещают образцы в криовиалы объемом 1,5 миллилитра, хранят их в самозамерзающем контейнере и сразу же переносят контейнеры в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов Цельсия. На следующий день переведите криовиалы в криогенное жидкое или воздушное фазовое хранение для длительного хранения.
Затем повторно суспендируют собранные небольшие и средние кластеры с 500 микролитрами предварительно нагретой 2X органоидной среды. Затем со стерильными наконечниками пипетки фильтра P-1000 добавьте BME в ячейки и аккуратно перемешайте. Быстро и осторожно пипсируйте 100 микролитров восстановленной клеточной смеси BME в скважины со сверхнизким креплением, плоскодонной 96-луночной пластиной, и поместите пластину в инкубатор на 20-30 минут для затвердевания.
После инкубации добавляют органоидную среду поверх суспензии клеток BME в соотношении один к двум в зависимости от эмпирически оцененного объема и помещают пластину в инкубатор на 20 минут для уравновешивания. После инкубации извлеките пластину из инкубатора и соберите ее на держателе образца на сцене микроскопа, чтобы визуально оценить органоиды при фазовом контрасте или настройках яркого поля. Доливайте среду каждые два-три дня, используя 50 микролитров предварительно нагретой органоидной среды, чтобы восполнить истощенные факторы роста и общий объем.
Получайте покадровые серийные изображения в дни 1, 2 и 3, а также 5, 7 и 10 перед прохождением. Двухчасовое переваривание ткани рака мочевого пузыря с коммерчески доступной коллагеназой / гиалуронидазой и ДНКазой I приводит к достаточному перевариванию от 0,5 до 1 кубического миллиметра кусочков более сложной ткани биопсии цистэктомии, включая опухолевые клетки в lamina propria и мышечных слоях мочевого пузыря. Более крупные фрагменты после пищеварения подходят для культивирования и стандартных тканевых культуральных пластин любого размера для выделения новых двухмерных культур.
Органоиды, генерируемые этой процедурой, подвергаются динамической самосборке, включая фазы агрегации, уплотнения и окончательного формирования плотных клеточных структур. Гистологически эти структуры рекапитулируют исходную опухоль пациента. Органоиды, образующиеся в этой процедуре, подходят для многих целей, включая дальнейшую гистопатологическую характеристику, биобанкинг и тестирование эффективности лекарств.
После генерации органоидов могут быть использованы дополнительные методы для профилирования этих опухолей, включая роль противораковой терапии, метаболического профилирования или профилирования транскрипции. В рамках этой 3D-структуры эти дополнительные методологии дают мощное представление о биологии рака мочевого пузыря. Этот метод был важной основой для исследований, изучающих иммуноонкологию и клеточный метаболизм.
