Этот эксперимент подчеркивает терапевтическую ценность антител Anti-c-fms при заболеваниях воспалительных нарушений костей, таких как ревматоидный артрит и пародонтит. Процесс, с помощью которого костный мозг извлекается и используется для генерации прекурсоров остеокласта, дает большое количество чистых остеокластов, которые могут быть использованы в нескольких приложениях вниз по течению. Этот протокол предоставляет два альтернативных метода остеокластогенеза, либо с использованием RANKL лиганд или TNF альфа.
В дополнение к этому, этот метод дает представление о влиянии антител Anti-c-fms на остеокластогенез. Визуальная демонстрация этой процедуры знакомит исследователя с процессом вскрытия и получения клеток костного мозга в больших количествах. Для начала заполните пластину, которая будет служить в качестве контейнера для сбора с примерно 50 миллилитров альфа MEM, в зависимости от размера контейнера, и поместите его на лед.
Используйте булавки, чтобы пробить через ладони и ноги усыпляемой мыши, чтобы исправить его в положении на спине, и спрей тщательно с 70% этанола. Используйте стерильные хирургические ножницы и пинцет, чтобы сделать разрез кожи на уровне бедра и расширить его до ног, подвергая мышцы. Найдите и вырежьте сухожилие, прикрепляя четырехглавую мышцу.
Очистите мышцу и вырежьте ее на уровне бедра. Затем найдите сухожилие, прикрепляя мышцу подколенного сухожилия к кости. Очистите мышцы подвергая кости, и освободить подколенное сухожилие от его привязанности, убедившись, что не разрезать на кости.
Распоить ножницы между головой бедренной кости и суставного пространства. Нарежьте его, освободив бедренную кость, но сохраняя кость нетронутой, что позволит отслоить кости без риска разоблачения костного мозга. Отрежьте мышцы, прикрепленные к голени аналогичным образом.
Затем вырезать голени свободной от его вложения в голеностопный сустав, сохраняя при этом кости нетронутыми, чтобы избежать загрязнения. Используйте ножницы лезвия и лабораторные салфетки, чтобы соскребать любые оставшиеся мягкие ткани из бедренной кости и голени и поместить их в подготовленную тарелку с альфа-MEM размещены на льду. Вскрытие должно проводиться тщательно, чтобы свести к минимуму загрязнение.
Именно поэтому тщательное удаление мягких тканей и локализация костей имеют решающее значение. Заполните шприц иглы 30-го калибра альфа-MEM. Отключите голени и бедренной кости от коленного сустава, и сократить концы длинной кости с обеих сторон с помощью ножниц.
Используйте пинцет, чтобы держать кость от вала. Вставьте иглу в пространство костного мозга к кости и медленно промыть содержимое костного мозга в шесть сантиметров культуры блюдо и повторить для всех костей. Кость побелеет, что указывает на извлечение всего содержимого костного мозга.
Используйте 40-метровый нейлоновый клеточный ситечко, чтобы процедить экстракт костного мозга в 50-миллилитровую коническую центрифугу. Центрифуга трубки при 300 раз G в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта.
Для мытья добавьте в гранулы пять миллилитров альфа-MEM. Пипетт клетки, чтобы отделить их, центрифуга, и повторить мыть в общей сложности два раза. После подсчета этих изолированных клеток, как описано в рукописи, семя 10 миллионов клеток на 10 миллилитров, в 10 сантиметров культуры блюдо, и добавить M-CSF в клетки.
Инкубировать культуру при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислого газа в течение трех дней. Удалить среды через три дня, и мыть клетки дважды энергично с 10 миллилитров PBS для удаления неадхерентных клеток. Добавьте пять миллилитров комнатной температуры 0,02%трипсина-ЭДТА и PBS, и инкубировать при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислого газа в течение пяти минут.
Тщательно пипетки клетки, чтобы отделить их. Наблюдайте за культурой под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки были отделены и появляются округлые и плавающие в средствах массовой информации. Когда клетки были отделены, инактивировать реакцию, добавив пять миллилитров альфа-MEM.
Соберите клетки в 50 миллилитров конической трубки и центрифуги в 300 раз G в течение пяти минут. После отбрасывания супернатанта, мыть с пятью миллилитров альфа MEM, и центрифуга снова в 300 раз G в течение пяти минут. Повторно приостанавливайте гранулы в 10 миллилитров альфа-MEM.
Семя 1 миллион клеток на 10 миллилитров в 10 сантиметров культуры блюдо, и добавить M-CSF. Инкубировать культуру при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислого газа в течение трех дней. Урожай прикрепленных клеток, которые представляют BMMs как прекурсоры остеокласта после трех дней, как это было сделано ранее во время генерации BMMs.
Семя BMMs на 50000 клеток на 200 микролитров альфа-MEM в 96 пластины хорошо на колодец. К каждому хорошо, добавить желаемые стимулы. А затем добавьте M-CSF для окончательной концентрации 100 нанограмм на миллилитр.
Добавьте антитела Anti-c-fms к каждому наилучшим образом. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию, 5%углекислого газа в течение четырех дней, при изменении средств массовой информации через день в течение четырех дней. А затем приступить к окрашивания и анализы, как описано в рукописи.
Оценивалось образование остеокласта в обработанных культурах M-CSF и RANKL с антителами Anti-c-fms. При 101 000 нанограммах на миллилитр анти-c-fms антитела, значительное снижение числа остеокластов наблюдалось по сравнению с контролем. В то время как, с одним из 10 нанограмм на миллилитр Анти-C-FMs антитела, не было значительного снижения.
Затем было оценено образование остеокласта в альфа-культуре M-CSF и TNF с антителами Anti-c-fms. С 10, 100, 1000 нанограммов на миллилитр Анти-c-fms антитела, значительное снижение числа остеокластов наблюдалось по сравнению с контролем, без существенного снижения на один нанограмм на миллилитр. И культура M-CSF с 1, 10, 100 нанограммами на миллилитр анти-c-fms антитела, не было никакого значительного снижения числа предшественников остеокласта по сравнению с контролем.
Тем не менее, на 1000 нанограмм на миллилитр, было значительное снижение числа прекурсоров остеокласта, что свидетельствует о том, что концентрация выше, чем 1000 нанограмм на миллилитр необходимо значительно ингибировать распространение прекурсоров остеокласта. Убедитесь в том, чтобы освободить облигации, сохраняя при этом кости нетронутыми, что позволит свести к минимуму вероятность загрязнения.
