Пещерные животные обеспечивают непреодолимую систему для исследования различных морфологических, развития и поведенческих признаков. Но одним из ограничивающих факторов в создании этой модельной системы является отсутствие генетических инструментов, которые позволили бы нам манипулировать функцией генов. Здесь мы демонстрируем три различных подхода к манипулированию функцией генов у мексиканской пещерной рыбы Astyanax mexicanus.
Эти инструменты позволят изузнать гены, лежащие в основе естественных вариаций между поверхностными рыбами и пещерными рыбами, и то, как они соотносятся с фенотипами. Бетани Шталь, талантливая постдок в моей лаборатории, продемонстрирует эту процедуру. Перед началом процедуры, заполнить 100 миллилитров Петри блюдо с теплой 3%agarose растворяется в воде рыбной системы и тщательно поместите форму инъекции яйца в агарозу под углом 45 градусов, прежде чем медленно опуская плесень в агарозу, чтобы избежать захвата воздуха под плесенью.
Когда агароза затвердеет, тщательно удалите форму, затем храните тарелку при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Затем вытяните иглы из борозиликатных стеклянных капилляров и электрода иглы шкив в соответствии с руководящими принципами производителя. В день инъекции используйте стеклянную пипету для переноса одноклеточных яиц в инъекционной пластине, заполняя до пяти рядов инъекционной пластины 30-40 яйцами в ряд.
Держите яйца гидратированных с небольшим количеством воды системы рыбы. Оттепель Morpholino на льду и подготовить инъекционный раствор так, что 400 пикограмм Morpholino вводится на яйцо с помощью длинного Microloader пипетки отзыв или добавить два-четыре микролитер болюс до конца. Когда все иглы были загружены, используйте типсы, чтобы обрезать избыток длины от иглы советы инъекции и смонтировать первую иглу в микроманипулятор подключен к пиколитер микроинъектора.
Затем поместите инъекционной тарелки под рассечение микроскопа и использовать микроманипулятор, чтобы проникнуть каждое яйцо с иглой, прежде чем вводить один нанолитер Morpholino инъекционный раствор непосредственно в желток. Для инъекций CRISPR смешайте 25 пикограмм направляющих РНК с 300 пикограммами РНК-мессенджера CRISPR-ассоциированного белка 9 и ввилит в каждый эмбрион два нанолитров полученного раствора РНК, как это было продемонстрировано. Для транспозазы Tol2 и фланговой плазмидной инъекции Tol2 объедините 25 нанограммов на микролитер РНК посыльного Tol2 с 25 нанограммами на микролитер плазмидной конструкции Tol2 и феноловый красный в воде без RNase.
Затем ввими один нанолитер раствора в каждый эмбрион, как только что продемонстрировано. Для проверки Morpholino-инъекционных животных в течение четырех дней после инъекции, в зависимости от гена интереса, визуализировать личинки рыб под стерео микроскопом для наблюдения фенотипа инъекционных животных или видеозаписи для измерения поведения. Для проверки инделей CRISPR перенесите в ПЦР эмбрионы, введенные CRISPR, и извлекайте ДНК в соответствии со стандартными протоколами извлечения ДНК для полимеразной цепной реакции или анализа ПЦР.
Для оценки мутагенеза запустите пять микролитров продукта ПЦР на 3%агарозном геле при 70 вольтах в течение трех часов. Дикий тип, не мутагенизированные ДНК приведет к отдельной полосе, в то время как мутант ДНК приведет к smeary полосы. Пещера Mexicanus вводили с контролем Morpholino экспонатов значительно больше локомотивной активности и снижение сна в течение 24-часового периода, по сравнению с поверхностными рыбами вводили с омлетом Morpholino.
Инъекция гипокретина orexin Morpholino имеет мало влияния на сон в поверхностных рыб по сравнению с контролем вводили рыбы. В отличие от этого, гипокретин orexin нокдаун через инъекцию Morpholino оказывает значительное влияние на сон в пещерных рыб, обеспечивая прямую связь между гипокретин orexin выражение и потеря сна. CRPSR-опосредованное mutagenesis гена альбинизма OCA2 в поверхностных рыбах приводит к в некоторых индивидуалах homozygous для одичал-типа OCA2 положительный аллель, и связано с укрывать пигментацию, тогда как индивидуалы которые имеют 2 экземпляра CRISPR-мутировавшего OCA2 отрицательный аллель альбинос, обеспечивая прямую связь между мутантным геном OCA2 и альбинизмом в пещере рыб.
Выберите положительный F0 для Tol2 передаваемого трансгена обратно крест к дикому типу для создания стабильных линий F1. Это позволяет живую визуализацию кальция для выявления различий в активности нейронов, посредничества поведенческих изменений в пещерной среде, закладывая основу для выражения многих дополнительных трансгенов для характеристики и манипулирования функцией генов в A mexicanus. Наиболее важные вещи, чтобы помнить, чтобы загрузить яйца плотно на тарелку, чтобы обрезать иглу должным образом, и оптимизировать микроинъекции.
После успешного генетического нокдауна, трансгенной интеграции или редактирования генов при посредничестве CRISPR эти рыбы могут быть использованы для анализа развития, поведения и активности мозга.
