Модели необходимы для последовательно необходимых для имитации метастазов рака через взаимодействие с лимфатическими узлами. У пациентов как с колоректальным раком, так и с раком уротелеивых клеток мочевого пузыря. Наши ортопедические ксенографические модели, описанные в этой статье, могут помочь ответить на эти важные биологические вопросы и протестировать новые методы лечения эффективно и клинически соответствующим образом.
Наши ортопедические опухоли ксенотрансплантата, вырабатываемые у мышей, напоминают опухоль пациентов. В присутствии лимфатических узлов стромальных клеток обе модели имеют более высокую имплантацию опухоли и удаленные показатели метастазирования органов и места, которые имитируют метастатические модели человека. Кроме того, обе модели животных имеют нулевую процессуальную смертность.
После удаления пациентом производных опухолей от усыпанных мышей, использовать стерильные хирургические ножницы, чтобы фарш люцифераза положительные части опухоли как можно меньше в чашке Петри под капюшоном ламинарного потока. Перенесите кусочки опухоли в стерильную коническую трубку 50 мл. Для приготовления раствора дайджеста добавьте 10 мл коллагеназы типа 4, 80 микролитров гиалуронидазы и 160 микролитров дезоксирибонуклеазы типа 1 - 40 мл HBSS и смешайте путем инвертирования.
Добавьте 35-40 мл раствора пищеварения в фарш опухоли и инкубировать при 37 градусах по Цельсию с непрерывным вращением в течение 2 часов с периодической энергичной тряской. Чтобы удалить мусор после пищеварения, фильтр переваренной опухоли через стерильные 100 микрометровых клеток ситечко следуют фильтрации через 40 микрометровых клеток ситечко сохранения потока через в 50 мл трубки каждый раз и отбрасывая мусора. Чтобы вымыть свободные клетки, добавьте 20 мл HBSS в поток через и центрифугу при 329 раз гравитации в течение 5 минут.
Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в 30 мл HBSS. Перенесите 100 000 опухолевых клеток в стерильную коническую трубку 15 мл и добавьте 300 000 предварительно подготовленных свежих клеток HK. Центрифуга клетки в 329 раз тяжести в течение 5 минут и отказаться от супернатанта по аспирации.
Повторное использование ячеек в полной среде RPMI и держать на льду до готовности к использованию. Для подготовки животного к инъекциям клеток UCC используйте крем для удаления волос, чтобы побрить нижнюю часть нижней части спины 6-8-недельной самки мыши NOD-SCID. Для введения клеток UCC в мочевой пузырь, сначала создали монополярную электрокаутерную машину мощностью 4 Вт.
После обезболивания мыши поместите ее в положение на спине с мордой в конус изофлюранового носа и голой спиной, прочно заземленной на рассеянном электроде. Смазать 24 калибровочный ангиокатетер с смазочных желе, а затем вставить ангиокатетер мягко, но твердо через уретру мыши. Если катетер изгибается при входе, вставьте направляющий провод на полпути в катетер, чтобы обеспечить стабильность.
Затем полностью вставьте 0,64 миллиметра фиксированного ядра прямой направляющий провод 1 миллиметр мимо конца ангиокатетера. Держите монополярный штифт к направляющий провод в течение одной секунды, что позволяет электрическое раздражение слизистой оболочки мочевого пузыря. Прикрепите свежий стерильный ангиокатетер к шприцу блокировки 1 мл и нарисуйте до 200 микролитров клеток UCC, подготовленных на предыдущих этапах.
Удалите направляющий провод и ангиокатетер из уретры, а затем вставьте ангиокатетер со шприцем клеток, прикрепленных к нему. Введайте 50 микролитров клеток в мочевой пузырь мыши и чтобы клетки прилипли к стенке мочевого пузыря, подождите несколько секунд, прежде чем удалить ангиокатетер. Наконец, удалить мышь из изофлюран нос конуса и заземления площадку и наблюдать его в течение 1 часа после процедуры признаки бедствия.
Чтобы создать модель мыши CRC, поместите анестезировал 6-8 недельный мужчина NOD-SCID мыши в положении на спине под рассекающий микроскоп обеспечения морды и изофлюран нос конуса и передних конечностей с лентой для стабильности. Поместите небольшой объект, такой как небольшая секция марли под основанием хвоста, поднимая анус, чтобы улучшитьвизивость и угол. Используйте изогнутые смазанные тупые наконечником типсы, чтобы расширить анальный канал и подвергать дистальной анальной и ректальной слизистой оболочки и удалить фекалии.
Подключите стерильную 30-го калибра съемную иглу к 50 микролитровому стеклянной шприцу. Нарисуйте 10 микролитров опухолевых и HK-клеток клеточной подвески, подготовленных в предыдущих шагах в шприц. Ввените 10 микролитров в дистальный задний ректальный субмукоса 1-2 миллиметра над анальным каналом, чтобы не пройти в тазовую полость.
Наконец, удалить мышь из изофлюран нос конуса и наблюдать его в течение одного часа после процедуры признаки бедствия. Для еженедельного мониторинга первичной опухоли, печени и легких метастатической нагрузки в любой модели мыши, во-первых, вес мыши. Ввимите 150 мг/кг люциферина внутри перитонеально и подождите 5 минут, пока субстрат циркулирует в организме.
Поместите анестезированной мыши в биолюминесцентной системы визуализации с носом фиксированной в носовой конус убедившись, что область интереса, которая является брюшной стороне животного сталкивается с камерой для каждого изображения. Изображение мыши в положении лежа еженедельно для активности люциферазы. После нарезки и окрашивания парафин-встроенных изолированных тканей, наблюдать их с помощью мощного микроскопа.
В модели мыши UCC 83,3 процента животных генерировали первичные опухоли и отображали зависящий от времени рост первичной опухоли на основе еженедельных измерений биолюминесценции. В модели мыши CRC, 96.9% из мышей выросли главным образом туморы. В зависимости от опухоли пациента, рост опухоли мыши имел другой период задержки, что отражает разницу в клинических характеристиках пациентов.
Как в внутривезикных, так и внутри ректальных моделях инъекция опухолевых клеток породила ортопедические первичные опухоли. Кроме того, у 33,3% и 53,1% мышей, привитых клетками UCC и клетками CRC с клетками HK, соответственно, развились отдаленные метастазы органов. Гистопатологию ксенотрансплантатов в модели UCC сравнивали с первичной карциномой мочевого пузыря пациента.
Результаты окрашивания от ксенотрансплантатов были похожи на те, что были в оригинальной хирургической биопсии, подтверждая аналогичную морфологию тканей. Антитела к Ki67, маркер пролиферации клеток человека, показывает положительное ядерное окрашивание, указывающее на высокораспространяющиеся, быстрорастущие опухолевые клетки человека. Аналогичным образом, в модели CRC окрашивание H и E указывает на сходство архитектуры между ксенотрансплантатами и опухолями пациентов.
Антитела окрашивания против цитокератина 20 также показали аналогичную модель роста опухоли в обеих моделях CRC. Ключом к этим процедурам является мягкое, но твердое лечение животных. Практика с постоянной рукой является лучшим способом для выполнения этих методов безопасно и достижения наилучших результатов.
После того, как эти модели сделаны, несколько различных форм лечения рака могут быть проверены, в том числе комбинации современных препаратов, а также недавно разработанные методы лечения до клинических испытаний у пациентов. Важно помнить, что обработка как раковых клеток, так и игл должна выполняться опытным персоналом для их безопасности, а также для достижения оптимальных результатов.
