Modelle werden benötigt, um Krebsmetastasen durch die Interaktion mit Lymphknoten konsequent nachzuahmen. Bei Patienten mit Dickdarm- und Urothelzellkrebs der Blase. Unsere in diesem Beitrag beschriebenen orthotopischen xenographischen Modelle können helfen, diese wichtigen biologischen Fragen zu beantworten und neue Therapien effizient und klinisch relevant zu testen.
Unsere orthotopischen Xenograft-Tumoren, die bei Mäusen produziert werden, ähneln dem Tumor der Patienten. In Gegenwart von Lymphknoten-Stromalzellen haben beide Modelle eine höhere Tumorimplantation und entfernte Organmetastasierungsraten und -stellen, die menschliche metastasierende Muster imitieren. Außerdem haben beide Tiermodelle keine verfahrensbedingte Sterblichkeit.
Nach der Entfernung von Patienten-Tumoren von eingeschläferten Mäusen, verwenden Sie sterile chirurgische Schere, um Luziferase positive Tumorstücke so klein wie möglich in einer Petrischale unter einer laminaren Strömungshaube zu hacken. Übertragen Sie die Tumorstücke in ein steriles 50 ml konisches Rohr. Zur Herstellung der Verdauungslösung 10 ml Kollagenase Typ 4, 80 Mikroliter Hyaluronidase und 160 Mikroliter Desoxyribonuklease Typ 1 bis 40 ml HBSS hinzufügen und durch Invertieren mischen.
Fügen Sie 35-40 ml der Verdauungslösung zu gehackten Tumor und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit kontinuierlicher Rotation für 2 Stunden mit periodischem kräftigen Schütteln. Um Die Trümmer nach der Verdauung zu entfernen, filtern Sie den verdauten Tumor durch steriles 100-Mikrometer-Zellsieb, gefolgt von einer Filtration durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb, das den Durchfluss in einem 50 ml-Rohr jedes Mal rettet und die Trümmer entsorgt. Um freie Zellen zu waschen, fügen Sie 20 ml HBSS in den Durchfluss und Zentrifuge bei 329-facher Schwerkraft für 5 Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 30 ml HBSS wieder auf. Übertragen Sie 100.000 Tumorzellen in ein steriles 15 ml konisches Rohr und fügen Sie 300.000 zuvor vorbereitete frische HK-Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 329-facher Schwerkraft für 5 Minuten und entsorgen Sie den Überstand durch Aspiration.
Setzen Sie die Zellen in komplettem RPMI-Medium wieder aus und halten Sie auf Eis, bis sie einsatzbereit sind. Um das Tier für die UCC-Zellinjektion vorzubereiten, verwenden Sie Haarentfernungscreme, um den unteren Rücken einer 6-8 Wochen alten weiblichen NOD-SCID-Maus zu rasieren. Um UCC-Zellen in eine Blase zu verabreichen, richten Sie zunächst eine monopolare Elektrokauter-Maschine mit einer Leistung von 4 Watt ein.
Nach der Anästhesisierung der Maus, legen Sie sie in Supine-Position mit seiner Schnarbe in einem Isofluran-Nasenkegel und nackten Rücken fest geerdet auf einer dispergierten Elektrode. Schmieren Sie einen 24 Gauge Angiokatheter mit Schmiergelee und legen Sie den Angiokatheter sanft, aber fest durch die Harnröhre der Maus ein. Wenn sich der Katheter beim Einstieg biegt, legen Sie den Führungsdraht auf halbem Weg in den Katheter ein, um Stabilität zu gewährleisten.
Dann legen Sie den 0,64 Millimeter festen Kern-Geradendraht 1 Millimeter hinter dem Ende des Angiokatheters vollständig ein. Halten Sie den Monopolstift eine Sekunde lang an den Führungsdraht, was eine elektrische Reizung der Blasenschleimhaut ermöglicht. Befestigen Sie eine frische, sterile Angiokatheter an 1 ml leur Schlossspritze und ziehen Sie bis zu 200 Mikroliter UCC-Zellen, die in früheren Schritten hergestellt wurden.
Entfernen Sie Führungsdraht und Angiokatheter aus der Harnröhre und setzen Sie dann Angiocatheter mit einer Spritze von Zellen ein, die daran befestigt sind. Injizieren Sie 50 Mikroliter der Zellen in die Mausblase und damit die Zellen an der Blasenwand haften, warten Sie einige Sekunden, bevor Sie den Angiokatheter entfernen. Schließlich entfernen Sie die Maus von Isofluran Nasenkegel und Erdungpad und beobachten Sie es für 1 Stunde nach dem Verfahren für Anzeichen von Not.
Um crC-Mausmodell zu erstellen, legen Sie eine anästhesierte 6-8 Wochen alte männliche NOD-SCID-Maus in Supine-Position unter einem Sezierendes Mikroskop, das die Schnaue und IsofluranNasenkegel und die vorderen Gliedmaßen mit Klebeband für Stabilität sichert. Platzieren Sie ein kleines Objekt wie einen kleinen Gazeabschnitt unter der Basis des Schwanzes, der den Anus erhöht, um die Visability und den Winkel zu verbessern. Verwenden Sie gekrümmte geschmierte stumpf gekippte Zangen, um den Analkanal zu verdünnen und die distale anale und rektale Schleimhaut freizulegen und Kot zu entfernen.
Schließen Sie eine sterile abnehmbare 30-Spur-Nadel an eine 50-Mikroliter-Glasspritze an. Zeichnen Sie 10 Mikroliter Tumor- und HK-Zellzellsuspension, die in früheren Schritten hergestellt wurden, in die Spritze. Injizieren Sie die 10 Mikroliter in die distale hintere rektale Submucosa 1-2 Millimeter über dem Analkanal, um sicherzustellen, dass sie nicht in die Beckenhöhle gelangen.
Schließlich entfernen Sie die Maus von Isofluran Nasenkegel und beobachten Sie es für eine Stunde nach dem Verfahren für Anzeichen von Not. Um wöchentlich die primäre Tumor-, Leber- und Lungenmetastasatheatheur in beiden Mausmodell zu überwachen, zuerst, wiegen Sie die Maus. Injizieren Sie 150 mg/kg Luziferin intraperitoneal und warten Sie 5 Minuten, bis das Substrat im Körper zirkuliert.
Legen Sie die anästhesierte Maus in ein biolumineszierendes Bildgebungssystem mit nase fixiert in Nasenkegel, um sicherzustellen, dass der Interessenbereich, die die ventrale Seite des Tieres ist, für jedes Bild der Kamera zugewandt ist. Bildmaus in supine Position wöchentlich für Luziferase-Aktivität. Nach dem Schneiden und Färben von paraffineingebetteten isolierten Geweben, beobachten Sie sie mit einem hochleistungsstarken Mikroskop.
Im UCC-Mausmodell erzeugten 83,3 Prozent der Tiere Primärtumoren und zeigten auf der Grundlage wöchentlicher Biolumineszenzmessungen ein zeitabhängiges primäres Tumorwachstum. Im CRC-Mausmodell wuchsen 96,9 % der Mäuse primär tumoren. Je nach Patiententumor hatte das Wachstum des Maustumors eine andere Latenzzeit, die den Unterschied in den klinischen Eigenschaften der Patienten widerspiegelt.
Sowohl in intravesikelals als auch in intrarektalen Modellen erzeugte die Tumorzellinjektion orthotopische Primärtumoren. Darüber hinaus entwickelten 33,3 % bzw. 53,1 % der Mäuse, die mit UCC-Zellen und CRC-Zellen mit HK-Zellen eingeflößt wurden, eine entfernte Organmetastasierung. Die Histopathologie von Xenografts im UCC-Modell wurde mit dem primären Blasenkarzinom des Primärpatienten verglichen.
Die Färbeergebnisse von Xenografts ähnelten denen in den ursprünglichen chirurgischen Biopsien und bestätigten eine ähnliche Gewebemorphologie. Antikörper gegen Ki67, einen menschlichen Zellproliferationsmarker, zeigt eine positive Kernfärbung, die auf hoch vermehrende, schnell wachsende menschliche Tumorzellen hinweist. In ähnlicher Weise zeigt h&E-Färbung im CRC-Modell die Ähnlichkeit der Architektur zwischen Xenografts und Patiententumoren an.
Antikörperfärbung gegen Cytokeratin 20 zeigte auch ähnliche Tumorwachstumsmuster in beiden CRC-Modellen. Der Schlüssel zu diesen Verfahren ist es, die Tiere sanft, aber fest zu behandeln. Üben mit einer ruhigen Hand ist der beste Weg, um diese Techniken sicher durchzuführen und die besten Ergebnisse zu erzielen.
Sobald diese Modelle hergestellt sind, können mehrere verschiedene Formen von Krebstherapien getestet werden, einschließlich Kombinationen von aktuellen Medikamenten sowie neu entwickelte Therapien vor klinischen Studien bei Patienten. Es ist wichtig, daran zu denken, dass der Umgang mit Krebszellen und nadeln von erfahrenem Personal zu ihrer Sicherheit sowie um optimale Ergebnisse zu erzielen.
