Les modèles sont nécessaires pour imiter constamment la métastase du cancer par l’interaction avec les ganglions lymphatiques. Chez les patients atteints à la fois d’un cancer colorectal et d’un cancer des cellules urotheliales de la vessie. Nos modèles orthotopiques xénographiques décrits dans cet article peuvent aider à répondre à ces questions biologiques importantes et tester de nouvelles thérapies efficacement et d’une manière cliniquement pertinente.
Nos tumeurs orthotopiques de xénogreffe produites chez les souris ressemblent à la tumeur des patients. En présence des cellules stromal de ganglion lymphatique les deux modèles ont une implantation plus élevée de tumeur et des taux éloignés de métastase d’organe et des emplacements qui imitent des modèles métastatiques humains. En outre, les deux modèles animaux n’ont aucune mortalité liée à la procédure.
Après avoir enlevé les tumeurs dérivées du patient des souris euthanasiées, utilisez des ciseaux chirurgicaux de stérilisation pour émincer des morceaux positifs de tumeur de luciferase aussi petits que possible dans une boîte de Petri sous un capot de flux laminaire. Transférer les morceaux de tumeur dans un tube conique stérile de 50 mL. Pour préparer la solution digeste, ajouter 10 mL de collagène de type 4, 80 microlitres d’hyaluronidase et 160 microlitres de désoxyribonuclease de type 1 à 40 mL de HBSS et mélanger en inversant.
Ajouter 35-40 mL de la solution digeste à la tumeur hachée et incuber à 37 degrés Celsius avec rotation continue pendant 2 heures avec des secousses vigoureuses périodiques. Pour enlever les débris après la digestion, filtrer la tumeur digérée par une passoire stérile de cellules de 100 micromètres suivie d’une filtration à travers une passoire cellulaire de 40 micromètres qui sauve le flux dans un tube de 50 mL à chaque fois et jette les débris. Pour laver les cellules libres, ajouter 20 mL de HBSS à l’écoulement et centrifugeuse à 329 fois la gravité pendant 5 minutes.
Aspirer le supernatant et réutiliser la pastille en 30 mL de HBSS. Transférer 100 000 cellules tumorales dans un tube conique stérile de 15 mL et ajouter 300 000 cellules HK fraîches préparées précédemment. Centrifuger les cellules à 329 fois la gravité pendant 5 minutes et jeter le supernatant par aspiration.
Resuspendez les cellules dans le milieu complet de RPMI et gardez sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi. Pour préparer l’animal à l’injection de cellules UCC utiliser de la crème d’épilation pour raser le bas du dos d’une souris femelle de 6-8 semaines NOD-SCID. Pour administrer les cellules UCC dans une vessie, installez d’abord une machine d’électrocauttérie monopolisaire à une puissance de 4 watts.
Après anesthésier la souris, placez-la en position supine avec son museau dans un cône nasal isoflurane et le dos nu solidement ancré sur une électrode dispersée. Lubrifier un angiocathéter de calibre 24 avec de la gelée lubrifiante, puis insérer l’angiocathéter doucement mais fermement à travers l’urètre de souris. Si le cathéter se plie à l’entrée, insérez le fil de guidage à mi-chemin dans le cathéter pour assurer la stabilité.
Ensuite, insérez entièrement le fil de guidage droit fixe de 0,64 millimètre 1 millimètre au-delà de l’extrémité de l’angiocathéter. Maintenez la goupille monopolisaire au fil de guidage pendant une seconde, ce qui permet une irritation électrique de la muqueuse vésicale. Fixez un angiocathéter frais et stérile à une seringue de verrouillage de 1 mL et dessinez jusqu’à 200 microlitres de cellules UCC préparés dans les étapes précédentes.
Retirez le fil de guidage et l’angiocathéter de l’urètre, puis insérez l’angiocathéter avec la seringue des cellules qui lui sont attachées. Injecter 50 microlitres des cellules à la vessie de la souris et pour permettre aux cellules d’adhérer à la paroi vésicale, attendre quelques secondes avant d’enlever l’angiocathéter. Enfin, retirez la souris du cône avant et de la garniture d’échouement d’isoflurane et observez-la pendant 1 heure suivant la procédure pour des signes de détresse.
Pour créer le modèle de souris CRC, placez une souris nod-SCID mâle anesthésiée de 6 à 8 semaines en position supinée sous un microscope disséquant le museau et le cône nasal isoflurane et les membres avant avec du ruban adhésif pour la stabilité. Placez un petit objet comme une petite section de gaze sous la base de la queue élevant l’anus pour améliorer la visabilité et l’angle. Utilisez des forceps à pointes émoussées lubrifiées incurvées pour dilater le canal anal et exposer la muqueuse anale et rectale distale et enlever les excréments.
Connectez une aiguille stérile amovible de calibre 30 à une seringue en verre de 50 microlitres. Dessiner 10 microlitres de la suspension cellulaire des cellules tumorales et hk préparé dans les étapes précédentes dans la seringue. Injecter les 10 microlitres dans le submucosa rectal postérieur distal 1-2 millimètres au-dessus du canal anal en s’assurant de ne pas passer dans la cavité pelvienne.
Enfin, retirez la souris du cône avant de l’isoflurane et observez-la pendant une heure après la procédure pour les signes de détresse. Pour surveiller chaque semaine la tumeur primaire, le foie et le poumon charge métastatique dans l’un ou l’autre modèle de souris, d’abord, peser la souris. Injecter 150 mg/kg de luciferine intra-péritonéally et attendre 5 minutes pour que le substrat circule dans le corps.
Placez la souris anesthésiée dans un système d’imagerie bioluminescente avec le nez fixé dans le cône du nez en s’assurant que la zone d’intérêt, qui est le côté ventral de l’animal est face à la caméra pour chaque image. Souris d’image dans la position supine hebdomadaire pour l’activité de luciferase. Après le tranchage et la coloration des tissus isolés incorporés par la paraffine, observez-les à l’aide d’un microscope de grande puissance.
Dans le modèle de souris UCC, 83,3 pour cent des animaux ont généré des tumeurs primaires et ont montré la croissance primaire dépendante du temps de tumeur basée sur des mesures hebdomadaires de bioluminescence. Dans le modèle de souris CRC, 96,9% des souris ont développé des tumeurs primaires. Selon la tumeur patiente, la croissance de tumeur de souris a eu une période différente de latence, qui reflète la différence dans les caractéristiques cliniques des patients.
Dans les modèles intra-vésiculeux et intra-rectal, l’injection de cellules de tumeur a généré des tumeurs primaires orthotopiques. En outre, 33,3% et 53,1% des souris inculquées avec des cellules UCC et des cellules CRC avec des cellules HK, respectivement, ont développé la métastase éloignée d’organe. L’histopathologie des xénogreffes dans le modèle d’UCC a été comparée au carcinome primaire de réservoir souple de patient.
Les résultats de coloration des xénogreffes étaient semblables à ceux dans les biopsies chirurgicales originales, confirmant la morphologie semblable de tissu. L’anticorps de Ki67, un marqueur de prolifération cellulaire humaine, montre des taches nucléaires positives indiquant une prolifération très proliférante des cellules tumorales humaines à croissance rapide. De même, dans le modèle CRC, la coloration H&E indique la similitude de l’architecture entre les xénogreffes et les tumeurs patientes.
La coloration d’anticorps contre la cytokeratine 20 a également montré le modèle semblable de croissance de tumeur dans les deux modèles de CRC. La clé de ces procédures est de traiter les animaux doucement, mais fermement. Pratiquer avec une main ferme est la meilleure façon d’effectuer ces techniques en toute sécurité et d’atteindre les meilleurs résultats.
Une fois ces modèles fabriqués, plusieurs formes différentes de thérapies contre le cancer peuvent être testées, y compris des combinaisons de médicaments actuels ainsi que des thérapies nouvellement développées avant les essais cliniques chez les patients. Il est important de se rappeler que la manipulation des cellules cancéreuses et des aiguilles doit être effectuée par du personnel expérimenté pour leur sécurité ainsi que pour obtenir des résultats optimaux.
