Modelos são necessários para imitar a metástase do câncer através da interação com linfonodos. Em pacientes com câncer colorretal e câncer de células urotelial da bexiga. Nossos modelos xenográficos ortotópicos descritos neste artigo podem ajudar a responder a essas importantes questões biológicas e testar novas terapias de forma eficiente e clinicamente relevante.
Nossos tumores ortotópicos de xenoenxerto produzidos em camundongos se assemelham ao tumor dos pacientes. Na presença de células estrogonais de linfonodos, ambos os modelos possuem maior implantação tumoral e taxas de metástase de órgãos distantes e locais que imitam padrões metastáticos humanos. Além disso, ambos os modelos animais têm mortalidade processual zero.
Depois de remover tumores derivados do paciente de camundongos eutanizados, use uma tesoura cirúrgica estéril para picar pedaços de tumores positivos da luciferase o menor possível em uma placa de petri sob uma capa de fluxo laminar. Transfira os pedaços do tumor em um tubo cônico estéril de 50 mL. Para preparar a solução de digestão, adicione 10 mL de colagenase tipo 4, 80 microlitros de hialuronidase e 160 microlitros de desoxiribonuclease tipo 1 a 40 mL de HBSS e misture invertendo.
Adicione 35-40 mL da solução de digestão ao tumor picado e incubar a 37 graus Celsius com rotação contínua por 2 horas com agitação vigorosa periódica. Para remover detritos após a digestão, filtrar o tumor digerido através de um coador celular estéril de 100 micrômetros seguido de filtragem através de um coador de células de 40 micrômetros salvando o fluxo através de um tubo de 50 mL cada vez e descartando os detritos. Para lavar células livres, adicione 20 mL de HBSS ao fluxo e centrífugue a 329 vezes a gravidade por 5 minutos.
Aspire o supernasce e resuspense a pelota em 30 mL de HBSS. Transfira 100.000 células tumorais para um tubo cônico estéril de 15 mL e adicione 300.000 células HK frescas previamente preparadas. Centrifugar as células a 329 vezes a gravidade por 5 minutos e descartar o supernatante por aspiração.
Resuspenda as células em meio RPMI completo e mantenha no gelo até estar pronto para uso. Para preparar o animal para injeção de células UCC use creme de depilação para raspar a parte inferior das costas de um rato nod-SCID fêmea de 6-8 semanas de idade. Para administrar células UCC em uma bexiga, primeiro configurou uma máquina de eletrocauteria monopolar a um poder de 4 watts.
Depois de anestesiar o rato, coloque-o em posição supina com seu focinho em um cone de nariz isoflurane e costas nuas firmemente aterrados em um eletrodo disperso. Lubrifique um angiocateter de calibre 24 com geleia lubrificante e, em seguida, insira o angiocateter suavemente, mas firmemente através da uretra do rato. Se o cateter dobrar na entrada, insira o fio-guia no meio do cateter para proporcionar estabilidade.
Em seguida, insira totalmente o fio de guia reto fixo de 0,64 milímetros 1 milímetro após a extremidade do angiocateter. Segure o pino monopolar no fio guia por um segundo permitindo uma irritação elétrica da mucosa da bexiga. Conecte um angiocateter fresco e estéril à seringa de bloqueio leur de 1 mL e elabore até 200 microliters de células UCC preparadas em etapas anteriores.
Remova o fio-guia e o angiocateter da uretra e, em seguida, insira angiocateter com seringa de células ligadas a ele. Injete 50 microliters das células na bexiga do rato e para permitir que as células aderam à parede da bexiga, espere alguns segundos antes de remover o angiocateter. Por fim, remova o rato do cone do nariz isoflurane e da almofada de aterramento e observe-o durante 1 hora após o procedimento para sinais de aflição.
Para criar o modelo de mouse CRC, coloque um rato nod-SCID masculino de 6 a 8 semanas de idade anestinado em posição supina sob um microscópio dissecando que protege o cone de nariz de focinho e isoflurane e os membros da frente com fita para estabilidade. Coloque um pequeno objeto, como uma pequena seção de gaze sob a base da cauda, elevando o ânus para melhorar a viabilidade e o ângulo. Use fórceps de pontas lubrificadas curvas para dilatar o canal anal e expor a mucosa anal e retal distal e remover fezes.
Conecte uma agulha removível de calibre 30 estéril a uma seringa de vidro de 50 microliter. Desenhe 10 microliters de tumor e suspensão celular HK preparado em etapas anteriores para a seringa. Injete os 10 microliters na submucosa retal posterior distal 1-2 milímetros acima do canal anal certificando-se de não passar para a cavidade pélvica.
Por fim, remova o rato do cone do nariz isoflurane e observe-o durante uma hora após o procedimento para sinais de aflição. Para monitorar semanalmente o tumor primário, a carga metastática do fígado e do pulmão em qualquer modelo de camundongo, primeiro, peso do camundongo. Injete 150 mg/kg de luciferina intra-peritoneally e espere 5 minutos para o substrato circular no corpo.
Coloque o rato anestesiado em um sistema de imagem bioluminescente com nariz fixo no cone do nariz certificando-se de que a área de interesse, que é o lado ventral do animal, está voltada para a câmera para cada imagem. Mouse de imagem em posição supina semanalmente para atividade de luciferase. Depois de cortar e coloriar tecidos isolados embutidos em parafina, observe-os usando um microscópio de alta potência.
No modelo de camundongos da UCC, 83,3% dos animais geraram tumores primários e apresentaram crescimento de tumor primário dependente do tempo com base em medidas semanais de bioluminescência. No modelo de camundongos CRC, 96,9% dos camundongos cultivaram tumores primários. Dependendo do tumor do paciente, o crescimento do tumor do camundongo teve um período de latência diferente, o que reflete a diferença nas características clínicas dos pacientes.
Tanto nos modelos intra-vesícula quanto nos intra-retal, a injeção de células tumorais gerou tumores primários ortotópicos. Além disso, 33,3% e 53,1% dos camundongos instilados com células UCC e células CRC com células HK, respectivamente, desenvolveram metástase de órgãos distantes. A histopatologia dos xenoenxertos no modelo UCC foi comparada com o carcinoma da bexiga do paciente primário.
Os resultados das manchas dos xenoenxertos foram semelhantes aos das biópsias cirúrgicas originais, confirmando morfologia de tecido semelhante. O anticorpo para Ki67, um marcador de proliferação de células humanas, mostra manchas nucleares positivas indicando células tumorais humanas altamente proliferadoras e de rápido crescimento. Da mesma forma, no modelo DEC, a coloração de H&E indica a semelhança da arquitetura entre xenoenxertos e tumores de pacientes.
A coloração de anticorpos contra citokeratina 20 também mostrou padrão de crescimento tumoral semelhante em ambos os modelos de CRC. A chave para esses procedimentos é tratar os animais suavemente, mas com firmeza. Praticar com uma mão firme é a melhor maneira de executar essas técnicas com segurança e alcançar os melhores resultados.
Uma vez que esses modelos são feitos, várias formas diferentes de terapias contra o câncer podem ser testadas, incluindo combinações de medicamentos atuais, bem como terapias recém-desenvolvidas antes de ensaios clínicos em pacientes. É importante lembrar que o manuseio tanto das células cancerígenas quanto das agulhas deve ser realizado por pessoas experientes para sua segurança, bem como para alcançar resultados ideais.
