Sono necessari modelli per imitare costantemente la metastasi tumorale attraverso l'interazione con i linfonodi. Nei pazienti con cancro del colon-retto e cancro delle cellule uroteliali della vescica. I nostri modelli xenografici ortotopici descritti in questo articolo possono aiutare a rispondere a queste importanti domande biologiche e testare nuove terapie in modo efficiente e clinicamente rilevante.
I nostri tumori xenograft ortotopici prodotti nei topi assomigliano al tumore dei pazienti. In presenza di cellule stromali linfonodo entrambi i modelli hanno un impianto tumorale più elevato e tassi di metastasi di organi distanti e posizioni che imitano i modelli metastatici umani. Inoltre, entrambi i modelli animali hanno zero mortalità procedurale.
Dopo aver rimosso i tumori derivati dal paziente dai topi eutanasiati, utilizzare forbici chirurgiche steril per tritare i pezzi di tumore positivi alla luciferasi il più piccolo possibile in una piastra di Petri sotto un cappuccio a flusso laminare. Trasferire i pezzi tumorali in un tubo conico sterile da 50 ml. Per preparare la soluzione digerimento, aggiungere 10 mL di collagenasi di tipo 4, 80 microlitri di ialuronidasi e 160 microlitri di deossiribonucleasi di tipo da 1 a 40 mL di HBSS e mescolare invertendo.
Aggiungere 35-40 mL della soluzione digeribile per tritare il tumore e incubare a 37 gradi Celsius con rotazione continua per 2 ore con scuotimento periodico vigoroso. Per rimuovere i detriti dopo la digestione, filtrare il tumore digerito attraverso un filtro cellulare sterile da 100 micrometri seguito dalla filtrazione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri salvando il flusso attraverso un tubo da 50 ml ogni volta e scartando i detriti. Per lavare le cellule libere, aggiungere 20 mL di HBSS al flusso attraverso e centrifugare a 329 volte la gravità per 5 minuti.
Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 30 mL di HBSS. Trasferire 100.000 cellule tumorali in un tubo conico sterile da 15 ml e aggiungere 300.000 cellule HK fresche precedentemente preparate. Centrifugare le cellule a 329 volte la gravità per 5 minuti e scartare il supernatante per aspirazione.
Rimospend le cellule in mezzo RPMI completo e tenere sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per l'uso. Per preparare l'animale per l'iniezione cellulare UCC utilizzare la crema per la depilazione per radere la parte bassa della schiena di un topo NOD-SCID femmina di 6-8 settimane. Per somministrare le cellule UCC in una vescica, impostare prima una macchina elettrocauteria monopolare a una potenza di 4 watt.
Dopo aver anestetizzato il topo, posizionarlo in posizione supina con il muso in un cono nasale isoflurane e schiena nuda saldamente messa a terra su un elettrodo disperso. Lubrificare un angiocatetere calibro 24 con gelatina lubrificante e quindi inserire l'angiocatetere delicatamente ma saldamente attraverso l'uretra del topo. Se il catetere si piega all'ingresso, inserire il filo guida a metà strada nel catetere per fornire stabilità.
Quindi, inserire completamente il filo di guida dritto a nucleo fisso da 0,64 millimetri 1 millimetro dopo l'estremità dell'angiocatetere. Tenere il perno monopolare al filo guida per un secondo consentendo un'irritazione elettrica della mucosa vescica. Attaccare un angiocatetere fresco e sterile a una siringa a leur lock da 1 ml e redigere fino a 200 microlitri di cellule UCC preparati nelle fasi precedenti.
Rimuovere il filo guida e l'angiocatetere dall'uretra e quindi inserire l'angiocatetere con siringa di cellule attaccate ad esso. Iniettare 50 microlitri delle cellule alla vescica del mouse e per consentire alle cellule di aderire alla parete della vescica, attendere alcuni secondi prima di rimuovere l'angiocatetere. Infine, rimuovere il mouse dal cono nasale isoflurane e dal cuscinetto di messa a terra e osservarlo per 1 ora seguendo la procedura per i segni di angoscia.
Per creare il modello di mouse CRC, posizionare un mouse NOD-SCID maschio di 6-8 settimane anestetizzato in posizione supina sotto un microscopio sezionante che fissa il muso e il cono nasale isoflurane e gli arti anteriori con nastro adesivo per la stabilità. Posizionare un piccolo oggetto come una piccola sezione di garza sotto la base della coda elevando l'ano per migliorare la visibilità e l'angolo. Utilizzare forcep con punta smussata lubrificata curva per dilatare il canale anale ed esporre la mucosa anale e rettale distale e rimuovere le feci.
Collegare un ago rimovibile sterile calibro 30 a una siringa in vetro da 50 microliter. Disegnare 10 microlitri di sospensione cellulare tumorale e delle cellule HK preparati nei passaggi precedenti nella siringa. Iniettare i 10 microlitri nella submucosa rettale posteriore distale 1-2 millimetri sopra il canale anale assicurandosi di non passare nella cavità pelvica.
Infine, rimuovere il topo dal cono nasale isoflurane e osservarlo per un'ora dopo la procedura per i segni di angoscia. Per monitorare settimanalmente il peso metastatico primario del tumore, del fegato e del polmone in entrambi i modelli di topo, prima, pesare il topo. Iniettare 150 mg/kg di luciferina per via intra-peritoneale e attendere 5 minuti che il substrato circoli nel corpo.
Posizionare il mouse anestetizzato in un sistema di imaging bioluminescente con il naso fissato nel cono del naso assicurandosi che l'area di interesse, che è il lato ventrale dell'animale, sia rivolta verso la fotocamera per ogni immagine. Mouse immagine in posizione supina settimanalmente per l'attività della luciferasi. Dopo aver affettato e macchiato tessuti isolati incorporati nella paraffina, osservali usando un microscopio ad alta potenza.
Nel modello di topo UCC, l'83,3% degli animali ha generato tumori primari e ha mostrato una crescita del tumore primario dipendente dal tempo basata su misurazioni settimanali della bioluminescenza. Nel modello di topo CRC, il 96,9% dei topi coltivava tumori primari. A seconda del tumore del paziente, la crescita del tumore del topo ha avuto un periodo di latenza diverso, che riflette la differenza nelle caratteristiche cliniche dei pazienti.
Sia nei modelli intra-vescicolari che intra-rettali, l'iniezione di cellule tumorali ha generato tumori primari ortotopici. Inoltre, il 33,3% e il 53,1% dei topi instillati con cellule UCC e cellule CRC con cellule HK, rispettivamente, hanno sviluppato metastasi d'organo distante. L'istopatologia degli xenoinnesti nel modello UCC è stata confrontata con il carcinoma della vescica del paziente primario.
I risultati di colorazione degli xenoinnesti erano simili a quelli delle biopsie chirurgiche originali, confermando una morfologia dei tessuti simile. L'anticorpo contro Ki67, un marcatore di proliferazione cellulare umana, mostra una colorazione nucleare positiva che indica cellule tumorali umane altamente proliferare e in rapida crescita. Allo stesso modo, nel modello CRC, la colorazione H&E indica la somiglianza dell'architettura tra xenografti e tumori del paziente.
La colorazione degli anticorpi contro la citocheratina 20 ha anche mostrato un modello di crescita tumorale simile in entrambi i modelli CRC. La chiave di queste procedure è trattare gli animali con delicatezza, ma con fermezza. La pratica con una mano ferma è il modo migliore per eseguire queste tecniche in sicurezza e ottenere i migliori risultati.
Una volta realizzati questi modelli, è possibile testare più diverse forme di terapie oncologiche, tra cui combinazioni di farmaci attuali e terapie di nuova sviluppo prima degli studi clinici nei pazienti. È importante ricordare che la manipolazione sia delle cellule tumorali che degli aghi dovrebbe essere eseguita da personale esperto per la loro sicurezza e per ottenere risultati ottimali.
