DRIT имеет важное значение, поскольку он обеспечивает диагностический тест на бешенство, который может быть выполнен в децентрализованных лабораториях в полевых условиях или в районах, не имеют регулярного доступа к электронной микроскопии. Основным преимуществом DRIT является то, что он использует только простую световую микроскопию и результаты могут быть получены примерно за один час. DRIT обеспечивает мощный экономичный инструмент для диагностики бешенства, который может быть использован лабораториями и полевыми биологами для улучшения эпиднадзора за бешенством, профилактики и контроля программ во всем мире.
Для животных, которые недавно собраны или были разморожены до температуры окружающей среды, положение животного supine на плоской поверхности с шейного отдела позвоночника слегка вращается в сторону эксперта. Пальпировать для выявления атланто-затылочной сустава на боковой аспект шейного отдела позвоночника. Используя лезвие скальпеля, сделайте разрез на уровне атланто-затылочной сустава в брюшном аспекте, прорезая все слои мышечной и мягкой ткани, включая трахею и пищевод.
Продолжайте до приближение переднего аспекта позвонков шейного отдела позвоночника. Затем переместите голову животного в расширение конечного диапазона до тех пор, пока стебель мозга не будет виден. Используйте лезвие скальпеля, чтобы удалить все видимые ствол мозга и ткани центральной нервной системы для образца.
Поместите образцы ствола мозга в нерушимый контейнер и этикетку соответственно. Во-первых, изутовьте окрашивание блюд, которые достаточно глубоки, чтобы обеспечить полное погружение в образец слайда. Заполните блюдо один с 10%фосфат буферных формалин.
Заполните блюда два, четыре и пять с TPBS. Заполните блюдо три с 3%перекисью водорода. Затем заполните посуду шестью, восемью, девятью и 10 дистиллированной или деионизированной водой.
Заполните блюдо семь с гематоксилин формулировки Гилл номер два разбавленной в соотношении 1:1 с дистиллированной водой. Для приготовления раствора запаса аминоэтилового карбазола, используя стеклянную пипетку, поместите пять миллилитров N, N-диметилформамида в стеклянную емкость. Добавьте 120 миллиграммовую таблетку 3-амино-9-этилкарбазола в стеклянный контейнер и встряхните до полного растворения.
Для подготовки рабочего разбавления AEC добавьте семь миллилитров буфера ацетата в 15 миллилитровую центрифугу. Используйте стеклянную пипетку, чтобы добавить 0,5 миллилитров раствора запаса AEC в трубку центрифуги. Добавьте 0,75 миллилитров 3%перекиси водорода.
Используйте 10 миллилитровый шприц с фильтром шприца 0,45 микрометра для фильтрации раствора. Для начала используйте мазок-доказательство водонепроницаемый постоянный маркер чернил для обозначения стеклянный микроскоп слайды с уникальным номером для каждого образца. Используйте лезвие скальпеля, чтобы удалить ствол мозга из контейнера и поместить его на бумажное полотенце.
Используйте второе бумажное полотенце, чтобы аккуратно смыть излишки жидкости, крови или меха, чтобы выявить только ткани ствола мозга. При необходимости раздел ткани ствола мозга, чтобы выявить поперечное сечение. Очень мягко коснитесь слайда микроскопа к нескольким точкам ствола мозга без бокового движения, чтобы позволить несколько областей ствола мозга быть переданы на слайд убедившись, что только один или два слоя клеток передаются из ткани мозга на слайд.
Пусть слайды высохнуть в течение примерно пяти минут при комнатной температуре. Затем погрузите горки в 10%buffered формалин в блюдо один в течение 10 минут. Удалите слайды из формалина и окуните их в раствор TPBS в блюде два.
Погрузите промытые горки в раствор перекиси водорода, содержащийся в блюде три в течение 10 минут. После этого снимите слайды с перекиси водорода и окуните их в свежий TPBS, содержащийся в блюде четыре. После удаления излишков перекиси водорода поместите слайды в свежее TPBS, содержащееся в блюде пять.
Возьмите слайды по одному из блюдо пять, стряхнуть и пятно любого избыточного буфера и поместите слайд на увлажненое бумажное полотенце на скамейке лаборатории. Когда все слайды были переданы, используйте капельницы или пипетки, чтобы отказаться от достаточного количества первичных антител вируса против бешенства на каждом слайде, чтобы покрыть ткани ЦНС. Обложка слайды с хорошо пластин или другой простой крышкой для создания камеры влажности и инкубировать слайды при комнатной температуре в камере в течение 10 минут.
После этого, удалить слайды из камеры влажности, встряхнуть и пятно от любого избытка спряжения и окунуть промыть горки в TPBS в блюдо пять. Работая с одним слайдом за один раз, удалить слайд из TPBS и использовать капельницы или пипетки, чтобы упасть достаточно стрептавидин пероксидазы комплекса для покрытия ткани ЦНС. После того, как все горки были покрыты, инкубировать их в камере влажности в течение 10 минут при комнатной температуре.
Затем удалите слайды из камеры влажности, встряхните и промокните любой избыточный комплекс и окуните полоскания горок в TPBS, содержащихся в блюде пять. Работая с одним слайдом за один раз, удалите слайд из TPBS и используйте пипетку, чтобы сбросить достаточное количество рабочего решения AEC для покрытия ткани ЦНС. Инкубировать горки в камере влажности в течение 10 минут при комнатной температуре.
После этого окуните горки в дистиллированную воду, содержащуюся в блюде шесть и поместите их в столешните гематоксилина Джилл в блюдо семь в течение двух минут. Немедленно окуните промыть все горки в дистиллированной воде в блюдо восемь. Повторите это дважды, используя пресную воду в блюдах 9 и 10 для каждой стирки.
Работая один слайд в то время, удалить слайд из воды и встряхнуть и смыть излишки воды. Используйте водорастворимую среду монтажа, чтобы прикрепить крышку к слайду. Затем используйте световой микроскоп с целью 20X для просмотра слайдов.
Положительные результаты DRIT показывают красные интрацитоплазмические вирусные включения, которые могут варьироваться по форме и размеру в цитоплазме голубоватых клеток. Включения выглядят гладкими с очень яркими полями и менее интенсивно окрашенных центральной области. Распределение антигена градуировано от плюс четырех до плюс одного с плюс четырьмя, представляющими распределение антигенов, состоящее из обилия больших и малых включений, меняющихся по размеру и форме и присутствующих в каждом поле зрения в пределах ткани ЦНС.
Распределение плюс три назначается при включении в различные размеры в большинстве, но не во всех областях представления. Если включения находятся в 10-50% полей микроскопа, назначается распределение антигена плюс один, когда включения находятся менее чем в 10% полей. Большинство тканей ЦНС с вирусом бешенства настоящее время экспонат типичных вирусных включений градуированных как плюс три или плюс четыре интенсивности и распределения антигена.
Если результаты указывают на плюс один или плюс два в интенсивности или распределении антигенов, образец объявляется неопределенным и повторное тестирование оправдано. Тестовый образец с использованием DRIT считается отрицательным для антигенов вируса бешенства после слайда, содержащего ткани ЦНС сканируется при увеличении 200X или больше, и типичные включения вируса не обнаружены. Отрицательные образцы обладают голубоватые тела клеток с мало или в отсутствие известных конкретных окрашивания.
Каждый человек, проводящий диагностическое тестирование на бешенство, должен пройти стандартную предэкспозавную вакцинацию против бешенства и пройти регулярную серологическую оценку антител. Неиммунизированные лица не должны въезжать в районы, где ведется такая работа. В дополнение к мерам предосторожности, принятых при работе с живым вирусом бешенства, некоторые из реагентов, используемых в тесте являются опасными.
Обратитесь к листам данных безопасности для каждого реагента.
