O DRIT é significativo porque fornece um teste de diagnóstico de raiva que pode ser realizado em laboratórios descentralizados no campo ou em áreas sem acesso rotineiro à microscopia eletrônica. A principal vantagem do DRIT é que ele utiliza apenas microscopia leve simples e os resultados podem ser obtidos em aproximadamente uma hora. O DRIT fornece uma poderosa ferramenta econômica para o diagnóstico da raiva que pode ser usada por laboratoriais e biólogos de campo para melhorar os programas de vigilância, prevenção e controle da raiva globalmente.
Para animais recém-coletados ou descongelados à temperatura ambiente, posicione o supino animal em uma superfície plana com a coluna cervical ligeiramente girada em direção ao examinador. Palpato para identificar a articulação atlanto-occipital no aspecto lateral da coluna cervical. Usando uma lâmina de bisturi, faça uma incisão ao nível da articulação atlanto-occipital no aspecto ventral cortando todas as camadas de músculo e tecido mole, incluindo a traqueia e o esôfago.
Continue até aproximar o aspecto anterior das vértebras cervicais da coluna vertebral. Em seguida, mova a cabeça do animal para uma extensão de alcance final até que o tronco cerebral seja visível. Use uma lâmina de bisturi para remover todo o tronco cerebral visível e tecido do sistema nervoso central para amostra.
Coloque as amostras do tronco cerebral em um recipiente inquebrável e rotule em conformidade. Primeiro, coloque pratos de coloração que são profundos o suficiente para permitir a imersão completa de um slide de amostra. Encha o prato um com formalina tamponada de fosfato de 10%.
Encha pratos dois, quatro e cinco com TPBS. Encha o prato três com 3% de peróxido de hidrogênio. Em seguida, encha os pratos seis, oito, nove e 10 com água destilada ou desionizada.
Encha o prato sete com a formulação de hematoxilina de Gill número dois diluída em uma proporção de 1:1 com água destilada. Para preparar a solução de estoque de amino-etil-carbazole, usando uma pipeta de vidro, coloque cinco mililitros de N, N-dimetilformamida em um recipiente de vidro. Adicione 120 miligramas de comprimido 3-amino-9-ethylcarbazole ao recipiente de vidro e agite até dissolver completamente.
Para preparar a diluição de trabalho da AEC, adicione sete mililitros de tampão de acetato a um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Use uma pipeta de vidro para adicionar 0,5 mililitros de solução de estoque AEC ao tubo centrífuga. Adicione 0,75 mililitros de solução de peróxido de hidrogênio de 3%.
Use uma seringa de 10 mililitros com um filtro de seringa de 0,45 micrômetros para filtrar a solução. Para começar, use um marcador de tinta permanente à prova d'água à prova de manchas para rotular lâminas de microscópio de vidro com um número único para cada espécime. Use uma lâmina de bisturi para remover o tronco cerebral do recipiente e coloque-o em uma toalha de papel.
Use uma segunda toalha de papel para apagar suavemente qualquer excesso de fluido, sangue ou pele para revelar apenas o tecido do tronco cerebral. Se necessário, seram o tecido do tronco cerebral para revelar uma seção transversal. Toque suavemente o slide do microscópio para vários pontos do tronco cerebral sem movimento lateral para permitir que várias áreas do tronco cerebral sejam transferidas para o slide certificando-se de que apenas uma ou duas camadas de células sejam transferidas do tecido cerebral para o slide.
Deixe o ar dos slides secar por aproximadamente cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, mergulhe os slides na formalina 10% tamponada no prato um por 10 minutos. Remova os slides da formalina e mergulhe-os na solução TPBS no prato dois.
Mergulhe os slides enxaguados na solução de peróxido de hidrogênio contida no prato três por 10 minutos. Depois disso, remova os slides do peróxido de hidrogênio e mergulhe-os no TPBS fresco contido no prato quatro. Depois de remover qualquer excesso de peróxido de hidrogênio, coloque os slides no TPBS fresco contido no prato cinco.
Pegue os slides um de cada vez do prato cinco, agite e limpe qualquer excesso de tampão e coloque o slide em uma toalha de papel umedecido no banco do laboratório. Quando todos os slides forem transferidos, use um conta-gotas ou pipeta para soltar anticorpos antirraiva primários suficientes em cada lâmina para cobrir o tecido CNS. Cubra os slides com placas de poço ou outra capa simples para criar uma câmara de umidade e incubar os slides à temperatura ambiente na câmara por 10 minutos.
Depois disso, remova os slides da câmara de umidade, agite e limpe qualquer excesso de conjugado e mergulhe os slides no TPBS no prato cinco. Trabalhando com um slide de cada vez, remova um slide do TPBS e use um conta-gotas ou pipeta para soltar o complexo peroxidase streptavidin suficiente para cobrir o tecido CNS. Uma vez que todos os slides tenham sido cobertos, incuba-os na câmara de umidade por 10 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, remova os slides da câmara de umidade, agite e limpe qualquer excesso complexo e mergulhe os slides no TPBS contidos no prato cinco. Trabalhando com um slide de cada vez, remova um slide do TPBS e use uma pipeta para soltar solução de trabalho AEC suficiente para cobrir o tecido CNS. Incubar os slides na câmara de umidade por 10 minutos em temperatura ambiente.
Depois disso, mergulhe os slides na água destilada contida no prato seis e coloque-os em uma contra-mancha de hematoxilina de Gill no prato sete por dois minutos. Imediatamente mergulhe todos os slides na água destilada no prato oito. Repita isso duas vezes usando a água doce nos pratos 9 e 10 para cada lavagem.
Trabalhando um slide de cada vez, remova um escorregador da água e agite e limpe qualquer excesso de água. Use um meio de montagem solúvel em água para fixar um deslizamento de tampas na lâmina. Em seguida, use um microscópio leve com um objetivo de 20X para visualizar os slides.
Os resultados positivos do DRIT mostram inclusões virais intracytoplasmáticas vermelhas que podem variar de forma e tamanho dentro do citoplasma dos corpos das células azuladas. As inclusões parecem suaves com margens muito brilhantes e uma área central menos intensamente manchada. A distribuição de antígenos é classificada de mais quatro para mais um com mais quatro representando distribuição de antígenos composta por uma abundância de grandes e pequenas inclusões variando em tamanho e forma e presentes em todos os campos de visão dentro da impressão de toque de tecido CNS.
Uma distribuição de mais três é atribuída quando há inclusões em uma variedade de tamanhos na maioria, mas não em todos os campos de visão. Se as inclusões forem encontradas em 10 a 50% dos campos de microscópio, uma distribuição de antígeno mais dois é atribuída enquanto mais uma é atribuída quando as inclusões são encontradas em menos de 10% dos campos. A maioria dos tecidos CNS com vírus da raiva presentes apresentam inclusões virais típicas classificadas como mais três ou mais quatro intensidade e distribuição de antígenos.
Se os resultados indicarem um mais um ou mais dois em intensidade ou distribuição de antígeno, a amostra é declarada indeterminada e o teste de repetição é justificado. Uma amostra de teste usando DRIT é considerada negativa para antígenos do vírus da raiva depois que a lâmina contendo o tecido CNS é escaneada a uma ampliação de 200X ou mais e nenhuma inclusão típica do vírus é detectada. Amostras negativas exibem corpos de células azuladas com pouca ou nenhuma coloração específica conhecida.
Cada pessoa que realiza testes de diagnóstico de raiva deve receber vacinação antirrábica pré-exposição padrão e passar por avaliação regular de anticorpos sorológicos. Indivíduos não imunizados não devem entrar em áreas onde esse trabalho está sendo realizado. Além das precauções tomadas ao trabalhar com o vírus da raiva viva, vários dos reagentes utilizados no teste são perigosos.
Consulte as folhas de dados de segurança de cada reagente.
