DRIT는 전자 현미경 검사법에 일상적인 접근이 없는 분야 또는 영역에서 분산된 실험실에서 수행할 수 있는 광견병 진단 테스트를 제공하기 때문에 중요합니다. DRIT의 주요 장점은 간단한 광 현미경 검사법만 을 이용하고 그 결과를 약 1시간 안에 얻을 수 있다는 것입니다. DRIT는 전 세계적으로 광견병 감시, 예방 및 제어 프로그램을 개선하기 위해 실험실 및 현장 생물학자가 사용할 수있는 광견병 진단을위한 강력한 경제적 도구를 제공합니다.
새로 채취되었거나 주변 온도로 해동된 동물의 경우 자궁 경부 척추가 검사관을 향해 약간 회전하는 평평한 표면에 동물 척추를 배치합니다. 팔파테는 자궁 경부 척추의 측면 측면에 아틀란토 -후현 관절을 식별합니다. 메스 블레이드를 사용하여 기관 및 식도를 포함한 모든 근육 과 연조직의 모든 층을 절단하는 복부 측면에서 아틀란토 후수 관절의 수준에서 절개를합니다.
자궁 경부 척추척추의 전방 측면을 근사화 할 때까지 계속하십시오. 그런 다음 뇌 줄기가 보일 때까지 동물의 머리를 엔드 레인지 확장으로 이동합니다. 메스 블레이드를 사용하여 눈에 보이는 뇌간과 중추 신경계 조직을 모두 제거하여 시료를 제거합니다.
뇌간 샘플을 깨지지 않는 용기에 넣고 그에 따라 라벨을 부착합니다. 먼저 샘플 슬라이드를 완벽하게 침수할 수 있을 만큼 깊은 스테이닝 요리를 준비합니다. 10% 인산염 완충 포어틴으로 접시를 채웁니다.
TPBS로 2, 4, 5의 요리를 채웁니다. 과산화수소 3%로 접시 3을 채웁니다. 그런 다음 6, 8, 9, 10을 증류수 또는 탈온물로 채웁니다.
증류수와 함께 1:1 비율로 희석된 길의 헤마톡클린 제형 2번으로 접시 7개를 채우세요. 아미노 에틸 카르바졸 스톡 용액을 준비하려면 유리 파이펫을 사용하여 N, N-디메틸포르마미드의 5밀리리터를 유리 용기에 놓습니다. 유리 용기에 3-아미노-9-에틸카르바졸120밀리그램 정제를 넣고 완전히 녹을 때까지 흔들어 줍니다.
AEC 작업 희석을 준비하려면 15밀리리터 원심분리기 튜브에 7밀리리터의 아세테이트 버퍼를 추가합니다. 유리 파이펫을 사용하여 원심분리기 튜브에 AEC 스톡 솔루션 0.5 밀리리터를 추가합니다. 과산화수소 용액의 0.75 밀리리터를 추가합니다.
0.45 마이크로미터 주사기 필터가 있는 10 밀리리터 주사기를 사용하여 용액을 필터링합니다. 시작하려면 얼룩 방지 방수 영구 잉크 마커를 사용하여 각 시편에 고유 한 숫자로 유리 현미경 슬라이드에 라벨을 부착하십시오. 메스 블레이드를 사용하여 용기에서 뇌간을 제거하고 종이 타월에 놓습니다.
두 번째 종이 타월을 사용하여 과도한 액체, 혈액 또는 털을 부드럽게 제거하여 뇌간 조직만 드러냅니다. 필요한 경우, 단면을 드러내기 위해 뇌줄기 조직을 단면으로 분류합니다. 매우 부드럽게 현미경 슬라이드를 측면 이동 없이 뇌의 여러 지점에 터치하여 여러 개의 뇌간 영역을 슬라이드로 옮겨서 뇌 조직에서 슬라이드로 하나 또는 두 층의 세포만 전달되도록 합니다.
실온에서 약 5분 동안 공기를 건조시키십시오. 그런 다음 10% 버퍼링된 포르말린에 슬라이드를 10분 동안 접시에 담가 두십시오. 포르말린에서 슬라이드를 제거하고 접시 2의 TPBS 용액에 헹구십시오.
3분간 접시에 포함된 과산화수소 용액에 헹힌 슬라이드를 담급다. 그 후, 과산화수소에서 슬라이드를 제거하고 4 접시에 포함 된 신선한 TPBS에 헹구십시오. 과산화수소를 과도하게 제거한 후, 미끄럼틀을 접시 5에 포함된 신선한 TPBS에 놓습니다.
접시 5에서 한 번에 하나씩 슬라이드를 가져 와서 여분의 버퍼를 흔들고 실험실 벤치에 촉촉한 종이 타월에 슬라이드를 놓습니다. 모든 슬라이드가 전송되면 드롭퍼 또는 파이펫을 사용하여 각 슬라이드에 충분한 1 차 적인 광견병 바이러스 항체를 떨어 뜨려 CNS 조직을 덮습니다. 슬라이드를 잘 플레이트 또는 다른 간단한 커버로 덮고 습도 챔버를 만들고 챔버의 실온에서 10 분 동안 슬라이드를 배양하십시오.
그 후, 습도 챔버에서 슬라이드를 제거하고, 여분의 컨쥬게이트를 흔들어 블롯하고, 접시 5에서 TPBS의 슬라이드를 헹구십시오. 한 번에 하나의 슬라이드로 작업, TPBS에서 슬라이드를 제거하고 CNS 조직을 커버하기에 충분한 스트렙타비딘 peroxidase 복합체를 드롭 드롭 드롭 한 방울이나 파이펫을 사용합니다. 모든 슬라이드가 덮여나면 실온에서 10분 동안 습도 챔버에서 배양하십시오.
그런 다음 습도 챔버에서 슬라이드를 제거하고, 여분의 복합체를 흔들어 서 블롯하고 접시 5에 포함 된 TPBS의 슬라이드를 헹구십시오. 한 번에 하나의 슬라이드로 작업하면 TPBS에서 슬라이드를 제거하고 파이펫을 사용하여 CNS 조직을 덮을 수 있는 충분한 AEC 작업 솔루션을 떨어 뜨립니다. 실온에서 10 분 동안 습도 챔버에서 슬라이드를 배양하십시오.
그 후, 6접시에 담긴 증류수에 미끄럼틀을 헹구고 2분 동안 7분간 길의 헤마톡슬린의 카운터스테인에 넣습니다. 즉시 접시 8에 증류수에 모든 슬라이드를 헹구십시오. 담수를 사용하여 매스워시당 9번과 10을 사용하여 두 번 반복하십시오.
한 번에 하나의 슬라이드를 작업, 물에서 슬라이드를 제거하고 흔들어 여분의 물에서 얼룩. 슬라이드에 커버슬립을 부착하기 위해 수용성 장착 매체를 사용합니다. 그런 다음 20X 목표를 가진 가벼운 현미경을 사용하여 슬라이드를 봅니다.
DRIT의 긍정적인 결과는 홍홍색 세포 바디의 세포질 내의 모양 그리고 크기에서 변화할 수 있는 빨간 intracytoplasmic 바이러스 성 포함을 보여줍니다. 포함은 매우 밝은 여백과 덜 집중적으로 얼룩진 중앙 영역으로 매끄럽게 나타납니다. 항원 분포는 CNS 조직 터치 인상 내의 모든 시야에서 크고 작은 포함물질로 구성된 항원 분포를 나타내는 4개 이상의 플러스 4개에서 4개까지 등급이 매겨져 있습니다.
대부분의 경우 다양한 크기에 포함이 있지만 모든 뷰 필드에 포함될 때 3개 이상의 분포가 할당됩니다. 포함이 현미경 필드의 10~ 50%에서 발견되는 경우, 플러스 2항원 분포가 할당되고 1개는 필드의 10% 미만에서 발견될 때 할당됩니다. 광견병 바이러스를 가진 대부분의 CNS 조직은 3 개 이상의 4 개의 강도 및 항원 분포로 등급이 매겨진 전형적인 바이러스 포함을 나타낸다.
결과가 강도 또는 항원 분포에서 하나 또는 플러스 2를 나타내는 경우, 샘플은 불확정선언되고 반복 테스트는 보증된다. DRIT를 이용한 시험 샘플은 CNS 조직을 포함하는 슬라이드가 200배율 이상의 배율로 스캔되고 일반적인 바이러스 포함이 검출되지 않은 후 광견병 바이러스 항원에게 부정적인 것으로 간주됩니다. 음의 샘플은 알려진 특정 염색이 거의 또는 전혀 없는 푸른 색 세포 체를 나타낸다.
광견병 진단 테스트를 수행하는 각 사람은 표준 사전 노출 광견병 예방 접종을 받고 정기적 인 혈청 학적 항체 평가를 받아야합니다. 예방 접종을 받지 않은 개인은 그러한 작업이 수행되는 지역에 들어서는 안됩니다. 살아있는 광견병 바이러스로 작업할 때 취한 예방 조치 외에도 시험에 사용되는 시약 중 몇 가지는 위험합니다.
각 시약에 대한 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
