Le DRIT est important parce qu’il fournit un test de diagnostic de la rage qui peut être effectué dans des laboratoires décentralisés sur le terrain ou dans des zones sans accès systématique à la microscopie électronique. Le principal avantage du DRIT est qu’il n’utilise qu’une simple microscopie légère et que les résultats peuvent être obtenus en environ une heure. Le DRIT fournit un puissant outil économique pour le diagnostic de la rage qui peut être utilisé par les travailleurs et les biologistes de terrain pour améliorer les programmes de surveillance, de prévention et de lutte contre la rage à l’échelle mondiale.
Pour les animaux fraîchement recueillis ou décongelés à température ambiante, placez l’animal supiné sur une surface plane avec la colonne cervicale légèrement tournée vers l’examinateur. Palpate pour identifier l’articulation atlanto-occipital sur l’aspect latéral de la colonne cervicale. À l’aide d’une lame de scalpel, faire une incision au niveau de l’articulation atlanto-occipitale à l’aspect ventral de coupe à travers toutes les couches de muscle et de tissus mous, y compris la trachée et l’œsophage.
Continuer jusqu’à ce que l’aspect antérieur des vertèbres cervicales de la colonne vertébrale se approche. Déplacez ensuite la tête de l’animal dans une extension de la plage d’extrémité jusqu’à ce que le tronc cérébral soit visible. Utilisez une lame de scalpel pour enlever tous les tissus visibles du tronc cérébral et du système nerveux central pour l’échantillon.
Placez les échantillons de tronc cérébral dans un contenant incassable et étiquetez-les en conséquence. Tout d’abord, entacher les plats suffisamment profonds pour permettre l’immersion complète d’un échantillon de diapositives. Remplir le plat un de formaline tamponnée à 10 % de phosphate.
Remplissez les plats deux, quatre et cinq de TPBS. Remplissez le plat trois de peroxyde d’hydrogène à 3 %. Remplissez ensuite les plats six, huit, neuf et dix avec de l’eau distillée ou déionisée.
Remplissez le plat sept avec la formulation d’hématoxyline numéro deux de Gill diluée dans un rapport de 1:1 avec de l’eau distillée. Pour préparer la solution de stock d’amino-éthyl-carbazole, à l’aide d’une pipette en verre, placez cinq millilitres de N, N-diméthylformamide dans un récipient en verre. Ajouter un comprimé de 120 milligrammes de 3-amino-9-éthylcarbazole au récipient en verre et secouer jusqu’à dissolution complète.
Pour préparer la dilution de travail de l’AEC, ajoutez sept millilitres de tampon d’acétate à un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Utilisez une pipette en verre pour ajouter 0,5 millilitres de solution de stock AEC au tube de centrifugeuse. Ajouter 0,75 millilitres de solution de peroxyde d’hydrogène à 3 %.
Utilisez une seringue de 10 millilitres avec un filtre à seringues de 0,45 micromètre pour filtrer la solution. Pour commencer, utilisez un marqueur d’encre permanent étanche à l’épreuve du frottis pour étiqueter les diapositives au microscope en verre avec un numéro unique pour chaque spécimen. Utilisez une lame de scalpel pour enlever le tronc cérébral du récipient et le placer sur une serviette en papier.
Utilisez une deuxième serviette en papier pour éponger doucement tout excès de liquide, de sang ou de fourrure pour révéler seulement le tissu du tronc cérébral. Au besoin, sectionnez le tissu du tronc cérébral pour révéler une section transversale. Touchez très doucement la lame du microscope à plusieurs points du tronc cérébral sans mouvement latéral pour permettre de transférer plusieurs zones de tronc cérébral à la diapositive en s’assurant que seulement une ou deux couches de cellules sont transférées du tissu cérébral à la lame.
Laisser sécher l’air pendant environ cinq minutes à température ambiante. Puis immerger les diapositives dans la formaline tamponnée à 10% dans le plat un pendant 10 minutes. Retirez les glissières de la formaline et trempez-les rincer dans la solution TPBS dans le deuxième plat.
Immerger les glissières rincées dans la solution de peroxyde d’hydrogène contenue dans le plat trois pendant 10 minutes. Après cela, retirez les glissières du peroxyde d’hydrogène et trempez-les rincer dans le TPBS frais contenu dans le plat quatre. Après avoir enlevé tout excès de peroxyde d’hydrogène, placez les glissières dans le TPBS frais contenu dans le plat cinq.
Prenez les diapositives une à la fois à partir du plat cinq, secouer et éponger tout tampon excédentaire et placer la diapositive sur une serviette en papier humidifié sur le banc de laboratoire. Lorsque toutes les diapositives ont été transférées, utilisez un dropper ou une pipette pour déposer suffisamment d’anticorps antirabiques primaires sur chaque glissière pour couvrir le tissu du SNC. Couvrir les glissières de plaques de puits ou d’un autre couvercle simple pour créer une chambre d’humidité et incuber les glissières à température ambiante dans la chambre pendant 10 minutes.
Après cela, retirez les glissières de la chambre d’humidité, secouez et épongez tout excès conjugué et trempez les glissières dans le TPBS dans le plat cinq. En travaillant avec une diapositive à la fois, retirez une glissière du TPBS et utilisez un dropper ou une pipette pour laisser tomber suffisamment de peroxidase streptavidine complexe pour couvrir le tissu du SNC. Une fois que toutes les glissières ont été couvertes, incubez-les dans la chambre d’humidité pendant 10 minutes à température ambiante.
Retirez ensuite les glissières de la chambre d’humidité, secouez et épongez tout excès complexe et trempez les glissières dans le TPBS contenu dans le plat cinq. En travaillant avec une diapositive à la fois, retirez une glissière du TPBS et utilisez une pipette pour laisser tomber suffisamment de solution de travail AEC pour couvrir les tissus du SNC. Incuber les glissières dans la chambre d’humidité pendant 10 minutes à température ambiante.
Après cela, tremper rincer les diapositives dans l’eau distillée contenue dans le plat six et les placer dans un contre-tache d’hématoxyline de Gill dans le plat sept pendant deux minutes. Tremper immédiatement rincer toutes les diapositives dans l’eau distillée dans le plat huit. Répétez cette répéter deux fois en utilisant l’eau douce dans les plats neuf et 10 pour chaque lavage.
En travaillant une diapositive à la fois, retirez une glissade de l’eau et secouez et épongez tout excès d’eau. Utilisez un support soluble dans l’eau pour apposer un couvercle sur la lame. Ensuite, utilisez un microscope léger avec un objectif 20X pour voir les diapositives.
Les résultats positifs du DRIT montrent des inclusions virales intracytoplasmiques rouges qui peuvent varier dans la forme et la taille dans le cytoplasme des corps de cellules bleuâtres. Les inclusions semblent lisses avec des marges très brillantes et une zone centrale moins intensément tachée. La distribution d’antigène est classée de plus quatre à plus un avec plus quatre représentant la distribution d’antigène comprenant une abondance de grandes et petites inclusions variant dans la taille et la forme et présentes dans chaque champ de vision dans l’impression de contact de tissu de CNS.
Une répartition de plus trois est attribuée lorsqu’il y a des inclusions dans une variété de tailles dans la plupart, mais pas dans tous les champs de vision. Si des inclusions sont trouvées dans 10 à 50% des champs de microscope, une distribution plus deux d’antigène est assignée tandis que plus un est assigné quand des inclusions sont trouvées dans moins de 10% des champs. La plupart des tissus du SNC présentant le virus de la rage présentent des inclusions virales typiques classées comme plus trois ou plus quatre intensité et distribution d’antigène.
Si les résultats indiquent un plus un ou plus deux dans la distribution de l’intensité ou de l’antigène, l’échantillon est déclaré indéterminé et des tests répétés sont justifiés. Un échantillon d’essai utilisant le DRIT est considéré négatif pour les antigènes de virus de rage après que la glissière contenant le tissu de CNS soit scannée à un grossissement de 200X ou plus et aucune inclusion typique de virus n’est détectée. Les échantillons négatifs présentent des corps de cellules bleuâtres avec peu ou pas de taches spécifiques connues.
Chaque personne effectuant des tests diagnostiques de la rage devrait recevoir des vaccins standard contre la rage avant l’exposition et subir une évaluation régulière des anticorps sérologiques. Les personnes non immunisées ne devraient pas entrer dans les zones où de tels travaux sont effectués. En plus des précautions prises lors du travail avec le virus de la rage vivante, plusieurs des réachagents utilisés dans le test sont dangereux.
Consultez les fiches de données de sécurité pour chaque reagent.
