DrIT, alandaki ademi merkeziyetçi laboratuvarlarda veya elektron mikroskobuna rutin erişimi olmayan alanlarda yapabilen kuduz tanı testi sağladığı için önemlidir. DRIT'in en büyük avantajı sadece basit ışık mikroskobu ndan yararlanması ve sonuçların yaklaşık bir saat içinde elde edilebilmesidir. DRIT dünya çapında kuduz gözetim, önleme ve kontrol programlarını geliştirmek için laboratorians ve alan biyologlar tarafından kullanılabilecek kuduz tanısı için güçlü bir ekonomik araç sağlar.
Taze olarak toplanan veya ortam sıcaklığına kadar çözülmüş hayvanlar için, hayvan supine'i servikal omurga hafifçe incemuayeneye doğru döndürülürken düz bir yüzeye yerleştirin. Palpate servikal omurganın lateral yönü atlanto-oksipital eklem belirlemek için. Bir neşter bıçak kullanarak, trakea ve yemek borusu da dahil olmak üzere kas ve yumuşak doku tüm katmanları ile kesme ventral yönü atlanto-oksipital eklem düzeyinde bir kesi yapmak.
Servikal omurga omurlarının ön yönüne yaklaşana kadar devam edin. Sonra beyin sapı görünür kadar bir bitiş aralığı uzantısı içine hayvanın başını hareket ettirin. Örnek için tüm görünür beyin sapı ve merkezi sinir sistemi dokusu kaldırmak için bir neşter bıçak kullanın.
Beyin sapı örneklerini kırılmaz bir kap içine yerleştirin ve buna göre etiketleyin. İlk olarak, örnek bir slayt tam daldırma sağlamak için yeterince derin boyama yemekleri yola. Çanak birini %10 fosfat tamponlu formalin ile doldurun.
İki, dört ve beş tabakları TPBS ile doldurun. Çanak üç'ü %3 hidrojen peroksitle doldurun. Sonra damıtılmış veya deiyonize su ile altı, sekiz, dokuz ve 10 bulaşıkları doldurun.
Yediyi Gill'in hematoksilin formülasyonu yla doldurun. Bir cam pipet kullanarak amino-etil-karbazol stok çözeltisi hazırlamak için, bir cam kap içinde N, N-dimethylformmide beş mililitre yerleştirin. Cam kap için 3-amino-9-ethylcarbazole 120 miligram tablet ekleyin ve tamamen çözülene kadar sallayın.
AEC çalışma seyreltme hazırlamak için, 15 mililitrelik santrifüj tüp için asetat tampon yedi mililitre ekleyin. Santrifüj tüpüne 0,5 mililitre AEC stok çözeltisi eklemek için cam pipet kullanın. %3 hidrojen peroksit çözeltisi 0.75 mililitre ekleyin.
Çözeltiyi filtrelemek için 0,45 mikrometre şırınga filtreli 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Başlamak için, her numune için benzersiz bir sayı ile cam mikroskop slaytlar etiketlemek için bir yayma geçirmez su geçirmez kalıcı mürekkep işareti kullanın. Kaptan beyin sapı kaldırmak ve bir kağıt havlu üzerine yerleştirmek için bir neşter bıçak kullanın.
Sadece beyin sapı dokusunu ortaya çıkarmak için aşırı sıvı, kan veya kürkü hafifçe uzaklaştırmak için ikinci bir kağıt havlu kullanın. Gerekirse, bir kesit ortaya çıkarmak için beyin sapı dokusunu kesin. Çok nazikçe beyin sapı birkaç noktaya yanal hareket olmadan beyin sapı birden fazla alanda slayt transfer edilmesine izin vermek için sadece bir veya iki hücre tabakası beyin dokusundan slayt aktarılır emin olmak için mikroskop slayt dokunun.
Slaytlar oda sıcaklığında yaklaşık beş dakika kuru masını bekleyin. Daha sonra slaytları 10 dakika boyunca %10 arabelleğe aldanan formalin imi tabağa batırın. Formalin gelen slaytlar çıkarın ve çanak iki TPBS çözeltisi onları durulayın.
Durulanmış slaytları, çanak üç te bulunan hidrojen peroksit çözeltisi içinde 10 dakika batırın. Bundan sonra, hidrojen peroksit slaytlar çıkarın ve çanak dört bulunan taze TPBS onları durulayın. Herhangi bir aşırı hidrojen peroksit çıkardıktan sonra, taze TPBS çanak beş bulunan slaytlar yerleştirin.
Slaytları beş tabaktan teker teker alın, fazla tamponları silkeleyin ve temizleyin ve kaydırağı laboratuvar bankındaki nemlendirilmiş bir kağıt havlunun üzerine yerleştirin. Tüm slaytlar aktarıldığında, CNS dokusunu kapsayacak kadar birincil anti-kuduz virüsü antikoru her slayta düşürmek için bir damlalık veya pipet kullanın. Bir nem odası oluşturmak için iyi plakalar veya başka bir basit kapak ile slaytlar kapak ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında slaytlar kuluçka.
Bundan sonra, nem odasından slaytları çıkarın, çalkalayın ve herhangi bir fazla konjuge kapalı leke ve çanak beş TPBS slaytlar durulayın. Bir seferde bir slayt ile çalışma, TPBS bir slayt kaldırmak ve CNS doku kapsayacak kadar Streptavidin peroksidaz kompleksi damla bir damlalık veya pipet kullanın. Tüm slaytlar kapatıldıktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca nem odasında kuluçkaya yatırın.
Daha sonra slaytları nem odasından çıkarın, fazla kompleksi sallayın ve lekeleyin ve çanak beşte yer alan TPBS'deki slaytları durulayın. Aynı anda tek bir slaytla çalışarak, TPBS'den bir slayt çıkarın ve CNS dokusunu kapsayacak kadar AEC çalışma solüsyonu bırakmak için bir pipet kullanın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca nem odasında slaytlar kuluçka.
Bundan sonra, altı tabakta bulunan distile suda slaytları durulayın ve iki dakika boyunca yedi dakika boyunca gill'in hematoksin bir karşı leke yerleştirin. Hemen bulaşık sekiz distile su damıtılmış su tüm slaytlar durulayın. Her yıkama için 9 ve 10 tabaklarda tatlı su kullanarak bunu iki kez tekrarlayın.
Bir seferde bir slayt çalışma, sudan bir slayt çıkarın ve sallamak ve herhangi bir fazla su leke. Slayta bir kapak kayması yapıştırmak için suda çözünen bir montaj ortamı kullanın. Ardından slaytları görüntülemek için 20X hedefi olan bir ışık mikroskobu kullanın.
DRIT'ten elde edilen olumlu sonuçlar, mavimsi hücre gövdelerinin sitoplazması içinde şekil ve boyut olarak değişebilen kırmızı intrasitoplazmik viral inklütümler göstermektedir. Eklemeler çok parlak kenar boşlukları ve daha az yoğun lekeli merkezi alan ile pürüzsüz görünür. Antijen dağılımı artı dört artı bir artı dört artı dört büyük ve küçük dahil büyük ve küçük dahil bir bolluk boyutu ve şekli ve CNS doku dokunmatik izlenim içinde görüş her alanda mevcut oluşan oluşan ile derecelendirilmiştir.
Artı üç dağılımı, görüş alanlarının çoğunda çeşitli boyutlarda eklemeler olduğunda atanır, ancak tüm görünüm alanlarında değil. Mikroskop alanlarının %10-50'sinde eklemeler bulunursa, alanların %10'undan azında eklemeler bulunduğunda artı bir antijen dağılımı atanır. Kuduz virüsü ile çoğu CNS dokular artı üç veya artı dört yoğunluk ve antijen dağılımı olarak dereceli tipik viral inklütifler mevcut.
Sonuçlar yoğunluk veya antijen dağılımında bir artı bir veya artı iki gösteriyorsa, örnek belirsiz olarak bildirilir ve tekrar testi garanti edilir. CNS dokusunu içeren slayt 200X veya daha büyük bir büyütme de tarandıktan sonra DRIT içeren bir test örneği kuduz virüsü antijenleri için negatif olarak kabul edilir ve tipik virüs inklümenleri tespit edilmeden sonra. Negatif örnekler de çok az veya hiç bilinen belirli boyama ile mavimsi hücre organları sergiler.
Kuduz tanı testi yapılan her kişi standart ön pozlama kuduz aşısı almalı ve düzenli serolojik antikor değerlendirmesinden geçmelidir. Aşısız bireyler bu tür çalışmaların yürütüldüğü alanlara girmemelidir. Canlı kuduz virüsü ile çalışırken alınan önlemlere ek olarak, testte kullanılan reaktiflerin bir çoğu tehlikelidir.
Her reaktif için güvenlik veri sayfalarına bakın.
