DRITは、現場の分散ラボや電子顕微鏡検査に日常的にアクセスできない領域で行うことができる狂犬病診断テストを提供するため、重要です。DRITの主な利点は、単純な光顕微鏡のみを利用し、約1時間で結果を得ることができるということです。DRITは、世界中の狂犬病の監視、予防、制御プログラムを改善するためにラボや現場生物学者が使用できる狂犬病診断のための強力な経済的ツールを提供します。
採取した動物や周囲温度まで解凍された動物の場合は、子宮頸部脊椎を審査官に向かってわずかに回転させて平らな表面に動物の上を置きます。頸椎の側面にアラント後頭関節を同定するパルパテ。メスの刃を使用して、気管および食道を含む筋肉および軟部組織のすべての層を切断する腹側の腹側のアトラント後頭部の関節のレベルで切開を行う。
頸椎椎の前側面に近いところまで続ける。次に、脳幹が見えるまで、動物の頭部をエンドレンジ拡張に移動します。メスの刃を使用して、サンプル用の目に見える脳幹と中枢神経系組織をすべて除去します。
脳幹サンプルを壊れない容器に入れ、それに応じてラベルを付けます。まず、サンプルスライドの完全な浸漬を可能にするのに十分な深さの染色皿を設定します。10%リン酸緩衝ホルマリンで皿1を充填します。
TPBSで料理2、4、5を満たします。3%過酸化水素で皿3を充填します。その後、蒸留または脱イオン水で6、8、9、10の料理を満たします。
蒸留水と1:1の比率で希釈したギルのヘマトキシリン製剤番号2で皿7を充填します。アミノエチルカルバゾールストック溶液を調製するために、ガラスピペットを用いて、5ミリリットルのN、N-ジメチルホルムアミドをガラス容器に入れる。ガラス容器に3-アミノ9-エチルカルバゾールの120ミリグラムの錠剤を加え、完全に溶解するまで振る。
AECの働き希釈を調製するには、15ミリリットルの遠心分離管に7ミリリットルの酢酸バッファーを加えます。ガラスピペットを使用して、遠心管に0.5ミリリットルのAECストック溶液を加えます。0.75ミリリットルの過酸化水素3%溶液を加えます。
0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して溶液をフィルター処理します。まず、スミアプルーフ防水永久インクマーカーを使用して、各標本に固有の番号でガラス顕微鏡スライドにラベルを付けます。メスの刃を使って容器から脳幹を取り出し、ペーパータオルの上に置きます。
2番目のペーパータオルを使用して、余分な液体、血液、毛皮を静かに消し去り、脳幹組織だけを明らかにします。必要に応じて、脳幹組織を切り離して断面を明らかにする。横の動きをせずに脳幹のいくつかのポイントに顕微鏡スライドを非常に穏やかに触れて、脳幹の複数の領域をスライドに移し、脳組織からスライドに1つまたは2つの層の細胞のみが転送されるようにします。
スライドを室温で約5分間乾燥させます。その後、10%緩衝ホルマリンにスライドを10分間浸します。ホルマリンからスライドを取り出し、皿2のTPBS溶液で浸す。
3皿に含まれる過酸化水素溶液にすすいスライドを10分間浸します。この後、過酸化水素からスライドを取り出し、皿4に含まれる新鮮なTPBSに浸します。余分な過酸化水素を除去した後、スライドを皿5に含まれる新鮮なTPBSに入れます。
皿5からスライドを一度に1つずつ取り、余分なバッファを振り払ってしみ、ラボベンチの湿らせたペーパータオルの上にスライドを置きます。すべてのスライドが転送されたら、スポイトまたはピペットを使用して、CNS組織を覆うのに十分な一次抗狂犬病ウイルス抗体を各スライドにドロップします。ウェルプレートまたは別の簡単なカバーでスライドを覆い、湿度チャンバーを作成し、チャンバー内の室温でスライドを10分間インキュベートします。
この後、湿度チャンバーからスライドを取り出し、余分なコンジュゲートを振ってブロットし、皿5のTPBSのスライドをすすぎます。一度に1つのスライドで作業し、TPBSからスライドを取り外し、スポイトまたはピペットを使用して、CNS組織をカバーするのに十分なストレプトアビジンペルオキシダーゼ複合体をドロップします。すべてのスライドを覆ったら、室温で10分間湿度室にインキュベートします。
その後、湿度チャンバーからスライドを取り出し、余分な複合体を振ってブロットオフし、皿5に含まれるTPBSでスライドをすすぎます。一度に1つのスライドで作業し、TPBSからスライドを取り外し、ピペットを使用してCNS組織をカバーするのに十分なAEC作業溶液をドロップします。室温で10分間湿度チャンバにスライドをインキュベートします。
この後、皿6に含まれる蒸留水にスライドをすすいで、ジルのヘマトキシリンのカウンターステインに2分間皿7に入れます。すぐに蒸留水のすべてのスライドを皿8にすすります。洗い物ごとに9皿と10の淡水を使用してこれを2回繰り返します。
一度に1つのスライドを作業し、水からスライドを取り除き、余分な水を振り払って消します。水溶性取り付け媒体を使用して、スライドにカバースリップを貼り付けます。次に、20倍の目的を持つ軽い顕微鏡を使用してスライドを見ます。
DRITからの肯定的な結果は、青みがかった細胞体の細胞質内の形状および大きさが変化し得る赤い細胞質内皮質ウイルス包括を示す。インクルージョンは、非常に明るいマージンとあまり集中的に染色された中央領域で滑らかに見えます。抗原分布は、CNS組織タッチ印象内のあらゆる視野に存在し、サイズと形状が変化し、存在する大小の包含の豊富さで構成される抗原分布をプラス4を加えたプラス4を伴うプラス4にグレードされる。
プラス 3 の分布は、ビューのフィールドのほとんどではなく、さまざまなサイズに含まれる場合に割り当てられます。顕微鏡分野の10~50%に含まれる場合、10%未満の視野で包含が見つかるとプラス1が割り当てられる間、プラス2つの抗原分布が割り当てられます。狂犬病ウイルスを有するほとんどのCNS組織は、3以上の強度と抗原分布をプラス3またはプラスとして等級付けされた典型的なウイルス包括を示す。
結果が強度または抗原分布のいずれかでプラス1またはプラス2を示す場合、サンプルは不確定であると宣言され、繰り返し検査が保証されます。DRITを用いた試験試料は、CNS組織を含むスライドを200倍以上の倍率でスキャンした後の狂犬病ウイルス抗原に対して陰性と考えられ、典型的なウイルスインクルージョンは検出されない。陰性サンプルは、既知の特定の染色をほとんどまたは全く有しない青みがかった細胞体を示す。
狂犬病診断検査を行う各人は、標準的な曝露前狂犬病の予防接種を受け、定期的な血清学的抗体評価を受けるべきである。単一の個人は、そのような作業が行われている領域に入るべきではありません。ライブ狂犬病ウイルスを扱う際の予防策に加えて、テストで使用される試薬のいくつかは危険です。
各試薬の安全性データシートを参照してください。
