Das DRIT ist wichtig, weil es einen Tollwut-Diagnosetest bietet, der in dezentralen Laboratorien vor Ort oder in Bereichen ohne routinemäßigen Zugang zur Elektronenmikroskopie durchgeführt werden kann. Der Hauptvorteil des DRIT ist, dass es nur einfache Lichtmikroskopie nutzt und die Ergebnisse in etwa einer Stunde erzielt werden können. Das DRIT bietet ein leistungsfähiges wirtschaftliches Werkzeug für die Tollwutdiagnose, das von Laboratoren und Feldbiologen zur Verbesserung von Tollwutüberwachungs-, Präventions- und Kontrollprogrammen weltweit eingesetzt werden kann.
Bei Tieren, die frisch gesammelt oder auf Umgebungstemperatur aufgetaut wurden, positionieren Sie die Tiersuppe auf einer ebenen Oberfläche, wobei die Halswirbelsäule leicht in Richtung des Prüfers gedreht ist. Palpate, um das Atlanto-Occipitalgelenk auf dem seitlichen Aspekt der Halswirbelsäule zu identifizieren. Mit einem Skalpellklinge, machen Sie einen Schnitt auf der Ebene der atlanto-okzipitalen Gelenk am ventralen Aspekt schneiden durch alle Schichten von Muskel und Weichgewebe einschließlich der Luftröhre und Speiseröhre.
Fahren Sie fort, bis sie den vorderen Aspekt der Halswirbelsäulenwirbel anrücken. Bewegen Sie dann den Kopf des Tieres in eine Endbereichsverlängerung, bis der Hirnstamm sichtbar ist. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um alle sichtbaren Hirnstamm und zentrale Nervensystem Gewebe für die Probe zu entfernen.
Legen Sie die Hirnstammproben in einen unzerbrechlichen Behälter und beschriften Sie sie entsprechend. Legen Sie zunächst Färbeschalen fest, die tief genug sind, um ein vollständiges Eintauchen einer Proberutsche zu ermöglichen. Füllen Sie Schale eins mit 10%phosphat gepuffertes Formalin.
Füllen Sie die Gerichte zwei, vier und fünf mit TPBS. Füllen Sie Schale drei mit 3%Wasserstoffperoxid. Dann füllen Sie die Gerichte sechs, acht, neun und zehn mit destilliertem oder entionisiertem Wasser.
Füllen Sie Schale sieben mit Gills Hämatoxylin-Formulierung Nummer zwei im Verhältnis 1:1 mit destilliertem Wasser verdünnt. Zur Herstellung der Amino-Ethyl-Carbazol-Stammlösung mit einer Glaspipette fünf Milliliter N, N-Dimethylformamid in einen Glasbehälter geben. 120 Milligramm Tablette 3-Amino-9-Ethylcarbazol in den Glasbehälter geben und schütteln, bis sie vollständig gelöst ist.
Zur Vorbereitung der AEC-Arbeitsverdünnung sieben Milliliter Acetatpuffer zu einem 15 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen. Verwenden Sie eine Glaspipette, um 0,5 Milliliter AEC-Lagerlösung in das Zentrifugenrohr zu geben. Fügen Sie 0,75 Milliliter 3%Wasserstoffperoxidlösung hinzu.
Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenfilter, um die Lösung zu filtern. Verwenden Sie zunächst einen abschmierenden wasserdichten permanenten Farbmarker, um Glasmikroskop-Dias mit einer eindeutigen Nummer für jede Probe zu kennzeichnen. Verwenden Sie eine Skalpellklinge, um den Hirnstamm aus dem Behälter zu entfernen und auf ein Papiertuch zu legen.
Verwenden Sie ein zweites Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit, Blut oder Fell sanft wegzuspülen, um nur das Hirnstammgewebe zu offenbaren. Bei Bedarf abschnitt das Hirnstammgewebe, um einen Querschnitt zu offenbaren. Berühren Sie das Mikroskop sehr sanft zu mehreren Punkten des Hirnstamms ohne seitliche Bewegung, um mehrere Bereiche des Hirnstamms auf das Dia übertragen zu können, um sicherzustellen, dass nur eine oder zwei Zellschichten vom Hirngewebe auf das Dia übertragen werden.
Lassen Sie die Dias bei Raumtemperatur ca. fünf Minuten trocknen. Dann tauchen Sie die Dias in die 10%gepufferte Formalin in Schale eins für 10 Minuten. Entfernen Sie die Dias aus dem Formalin und spülen Sie sie in der TPBS-Lösung in Schale zwei.
Die spülenden Dias 10 Minuten lang in die in Schale drei enthaltene Wasserstoffperoxidlösung eintauchen. Danach die Dias aus dem Wasserstoffperoxid entfernen und in die frischen TPBS in Schale vier abspülen. Nach dem Entfernen überschüssiger Wasserstoffperoxid, legen Sie die Dias in die frische TPBS in Schale fünf enthalten.
Nehmen Sie die Dias nacheinander von Teller fünf, schütteln Sie ab und bloten Sie überschüssigen Puffer und legen Sie die Folie auf ein befeuchtetes Papiertuch auf der Laborbank. Wenn alle Dias übertragen wurden, verwenden Sie einen Traber oder eine Pipette, um genügend primäre Anti-Tollwut-Virus-Antikörper auf jedem Dia fallen zu lassen, um das ZNS-Gewebe zu bedecken. Bedecken Sie die Dias mit Brunnenplatten oder einer anderen einfachen Abdeckung, um eine Feuchtigkeitskammer zu schaffen und die Dias bei Raumtemperatur in der Kammer für 10 Minuten zu bebrüten.
Danach entfernen Sie die Dias aus der Feuchtigkeitskammer, schütteln und bloten Sie überschüssigekonjugieren und tauchen Spülen Sie die Dias in der TPBS in Schale fünf. Wenn Sie mit einem Dia nach dem anderen arbeiten, entfernen Sie eine Folie aus dem TPBS und verwenden Sie einen Tressen oder eine Pipette, um genügend Streptavidin-Peroxidase-Komplex fallen zu lassen, um das ZNS-Gewebe zu bedecken. Sobald alle Rutschen abgedeckt sind, inkubieren Sie sie in der Feuchtigkeitskammer für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Dann entfernen Sie die Dias aus der Feuchtigkeitskammer, schütteln und bloten Sie jede überschüssige Komplex und tauchen Spülen Spülen sie die Dias in der TPBS in Schale fünf enthalten. Wenn Sie mit einem Schieberegler nach dem anderen arbeiten, entfernen Sie eine Folie aus dem TPBS und verwenden Sie eine Pipette, um genügend AEC-Arbeitslösung fallen zu lassen, um das ZNS-Gewebe zu bedecken. Inkubieren Sie die Dias in der Feuchtigkeitskammer für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Danach spülen Sie die Dias in dem in Schale sechs enthaltenen destillierten Wasser ab und legen Sie sie zwei Minuten lang in einen Gegenfleck von Gills Hämatoxylin in Schale sieben. Sofort alle Dias im destillierten Wasser in Schale acht abspülen. Wiederholen Sie dies zweimal mit dem Süßwasser in den Gerichten neun und 10 für jede Wäsche.
Arbeiten Sie eine Rutsche nach der anderen, entfernen Sie eine Rutsche aus dem Wasser und schütteln und ausloten überschüssiges Wasser. Verwenden Sie ein wasserlösliches Montagemedium, um einen Deckelschlupf am Schlitten zu befestigen. Verwenden Sie dann ein Lichtmikroskop mit einem 20-fachen Objektiv, um die Dias anzuzeigen.
Positive Ergebnisse des DRIT zeigen rote intrazytoplasmatische virale Einschlüsse, die in Form und Größe innerhalb des Zytoplasmas der bläulichen Zellkörper variieren können. Die Einschlüsse wirken glatt mit sehr hellen Rändern und einem weniger intensiv gefärbten Zentralen Bereich. Die Antigenverteilung wird von plus vier bis plus eins mit plus vier, die Antigenverteilung darstellen, die aus einer Fülle von großen und kleinen Einschlüssen mit unterschiedlicher Größe und Form besteht und in jedem Sichtfeld innerhalb des CNS-Gewebeberührungsabdrucks vorhanden ist, abgestuft.
Eine Verteilung von plus drei wird zugewiesen, wenn es Einschlüsse in verschiedenen Größen in den meisten, aber nicht in allen Sichtfeldern gibt. Wenn Einschlüsse in 10 bis 50 % der Mikroskopfelder gefunden werden, wird eine plus zwei Antigenverteilung zugewiesen, während plus eine zugewiesen wird, wenn Einschlüsse in weniger als 10 % der Felder gefunden werden. Die meisten ZNS-Gewebe mit Tollwut-Virus vorhanden zeigen typische virale Einschlüsse als plus drei oder plus vier Intensität und Antigen-Verteilung bewertet.
Wenn die Ergebnisse ein Plus eins oder plus zwei in der Intensitäts- oder Antigenverteilung angeben, wird die Probe als unbestimmt deklariert und Wiederholungstests sind gerechtfertigt. Eine Testprobe mit DRIT gilt als negativ für Tollwutvirus-Antigene, nachdem das Dia, das das ZNS-Gewebe enthält, mit einer Vergrößerung von 200X oder mehr gescannt wurde und keine typischen Viruseinschlüsse festgestellt werden. Negative Proben zeigen bläuliche Zellkörper mit wenig oder gar keiner bekannten spezifischen Färbung.
Jede Person, die Tollwut-Diagnosetests durchführt, sollte standardfarbene Tollwutimpfungen vor der Exposition erhalten und sich einer regelmäßigen serologischen Antikörperbewertung unterziehen. Nicht immunisierte Personen sollten nicht in Bereiche eintreten, in denen solche Arbeiten durchgeführt werden. Zusätzlich zu den Vorsichtsmaßnahmen bei der Arbeit mit lebenden Tollwutviren sind einige der im Test verwendeten Reagenzien gefährlich.
Beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter für jedes Reagenz.
