Il DRIT è significativo perché fornisce un test diagnostico della rabbia che può essere eseguito in laboratori decentralizzati sul campo o in aree senza accesso di routine alla microscopia elettronica. Il vantaggio principale del DRIT è che utilizza solo una semplice microscopia ottica e i risultati possono essere ottenuti in circa un'ora. Il DRIT fornisce un potente strumento economico per la diagnosi della rabbia che può essere utilizzato da laboratoriani e biologi sul campo per migliorare la sorveglianza della rabbia, i programmi di prevenzione e controllo a livello globale.
Per gli animali appena raccolti o scongelati a temperatura ambiente, posizionare la supina animale su una superficie piana con la colonna cervicale leggermente ruotata verso l'esaminatore. Palpato per identificare l'articolazione atlanto-occipitale sull'aspetto laterale della colonna cervicale. Utilizzando una lama bisturi, fare un'incisione a livello dell'articolazione atlanto-occipitale all'aspetto ventrale tagliando tutti gli strati di muscoli e tessuti molli tra cui la trachea e l'esofago.
Continuare fino ad approssimare l'aspetto anteriore delle vertebre cervicali della colonna vertebrale. Quindi spostare la testa dell'animale in un'estensione dell'intervallo finale fino a quando il tronco encefalico non è visibile. Utilizzare una lama bisturi per rimuovere tutto il tronco encefalico visibile e il tessuto del sistema nervoso centrale per il campione.
Posizionare i campioni del tronco encefalico in un contenitore infrangibile ed etichettare di conseguenza. In primo luogo, impostare piatti di colorazione abbastanza profondi da consentire l'immersione completa di una diapositiva campione. Riempire il piatto uno con formalina tamponata al 10%fosfato.
Riempi i piatti due, quattro e cinque con TPBS. Riempire il piatto tre con perossido di idrogeno al 3%. Quindi riempire i piatti sei, otto, nove e 10 con acqua distillata o deionizzata.
Riempire il piatto sette con la formulazione ematossilina di Gill numero due diluita in un rapporto 1:1 con acqua distillata. Per preparare la soluzione di stock di ammino-etile-carbazolo, utilizzando una pipetta di vetro, posizionare cinque millilitri di N, N-dimetilformamide in un contenitore di vetro. Aggiungere una compressa da 120 milligrammi di 3-ammino-9-etilecarbazolo al contenitore di vetro e agitare fino a completa dissoluzione.
Per preparare la diluizione di lavoro AEC, aggiungere sette millilitri di tampone di acetato a un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Utilizzare una pipetta di vetro per aggiungere 0,5 millilitri di soluzione stock AEC al tubo di centrifuga. Aggiungere 0,75 millilitri di soluzione di perossido di idrogeno al 3%.
Utilizzare una siringa da 10 millilitri con un filtro siringa da 0,45 micrometri per filtrare la soluzione. Per iniziare, utilizzare un pennarello permanente impermeabile a prova di striscio per etichettare diapositive al microscopio in vetro con un numero univoco per ogni campione. Utilizzare una lama bisturi per rimuovere il tronco encefalico dal contenitore e posizionarlo su un tovagliolo di carta.
Usa un secondo tovagliolo di carta per asciugare delicatamente qualsiasi fluido, sangue o pelliccia in eccesso per rivelare solo il tessuto del tronco encefalico. Se necessario, sessare il tessuto del tronco encefalico per rivelare una sezione trasversale. Toccare molto delicatamente lo scivolo del microscopio in diversi punti del tronco encefalico senza movimento laterale per consentire il trasferimento di più aree del tronco encefalico alla diapositiva assicurandosi che solo uno o due strati di cellule siano trasferiti dal tessuto cerebrale allo scivolo.
Lasciare asciugare i vetrini per circa cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi immergere le diapositive nella formalina tamponata al 10% nel piatto uno per 10 minuti. Rimuovere le diapositive dalla formalina e immergerle sciacquarle nella soluzione TPBS nel piatto due.
Immergere le diapositive risciacquate nella soluzione di perossido di idrogeno contenuta nel piatto tre per 10 minuti. Successivamente, rimuovere le diapositive dal perossido di idrogeno e immergerle sciacquarle nel TPBS fresco contenuto nel piatto quattro. Dopo aver rimosso qualsiasi perossido di idrogeno in eccesso, posizionare le diapositive nel TPBS fresco contenuto nel piatto cinque.
Prendere le diapositive una alla volta dal piatto cinque, scrollarsi di mente e tamponare qualsiasi tampone in eccesso e posizionare lo scivolo su un tovagliolo di carta inumidito sulla panchina del laboratorio. Quando tutte le diapositive sono state trasferite, utilizzare un contagocce o una pipetta per far cadere abbastanza anticorpo del virus antirabbica primario su ogni diapositiva per coprire il tessuto del SNC. Coprire gli scivoli con piastre di pozzo o un altro semplice coperchio per creare una camera di umidità e incubare gli scivoli a temperatura ambiente nella camera per 10 minuti.
Successivamente, rimuovere i vetrini dalla camera di umidità, agitare e cancellare qualsiasi coniugato in eccesso e immergere le diapositive nel TPBS nel piatto cinque. Lavorando con una diapositiva alla volta, rimuovere una diapositiva dal TPBS e utilizzare un contagocce o una pipetta per far cadere abbastanza complesso di perossidasi di Streptavidin per coprire il tessuto del SNC. Una volta che tutti gli scivoli sono stati coperti, incubarli nella camera di umidità per 10 minuti a temperatura ambiente.
Quindi rimuovere le diapositive dalla camera di umidità, agitare e cancellare qualsiasi complesso in eccesso e immergere sciacquare le diapositive nel TPBS contenute nel piatto cinque. Lavorando con una diapositiva alla volta, rimuovere una diapositiva dal TPBS e utilizzare una pipetta per far cadere abbastanza soluzione di lavoro AEC per coprire il tessuto DEL SNC. Incubare gli scivoli nella camera di umidità per 10 minuti a temperatura ambiente.
Successivamente, immergere sciacquare gli scivoli nell'acqua distillata contenuta nel piatto sei e metterli in una controsoffitta dell'ematossilina di Gill nel piatto sette per due minuti. Immergere immediatamente sciacquare tutti gli scivoli nell'acqua distillata nel piatto otto. Ripetere questo due volte usando l'acqua dolce nei piatti nove e 10 per ogni lavaggio.
Lavorando una diapositiva alla volta, rimuovere uno scivolo dall'acqua e agitare e asciugare l'acqua in eccesso. Utilizzare un mezzo di montaggio solubile in acqua per apporre un coverslip sul vetrino. Quindi utilizzare un microscopio a luce con un obiettivo 20X per visualizzare le diapositive.
I risultati positivi del DRIT mostrano inclusioni virali intracitoplasmache rosse che possono variare nella forma e nelle dimensioni all'interno del citoplasma dei corpi cellulari bluastre. Le inclusioni appaiono lisce con margini molto luminosi e un'area centrale meno intensamente macchiata. La distribuzione dell'antigene è graduata da più quattro a più uno con più quattro che rappresentano la distribuzione dell'antigene composta da un'abbondanza di inclusioni grandi e piccole che variano per dimensioni e forma e presenti in ogni campo visivo all'interno dell'impressione di tocco del tessuto DEL SNC.
Una distribuzione di più tre viene assegnata quando ci sono inclusioni in una varietà di dimensioni nella maggior parte ma non in tutti i campi di visualizzazione. Se le inclusioni si trovano nel 10-50% dei campi del microscopio, viene assegnata una distribuzione di antigeni più due, mentre più uno viene assegnato quando le inclusioni si trovano in meno del 10% dei campi. La maggior parte dei tessuti del SNC con virus della rabbia presenti presentano inclusioni virali tipiche classificate come più tre o più quattro intensità e distribuzione di antigeni.
Se i risultati indicano un più uno o più due nella distribuzione di intensità o antigene, il campione viene dichiarato indeterminato e il test di ripetizione è giustificato. Un campione di prova che utilizza DRIT è considerato negativo per gli antigeni del virus della rabbia dopo che la diapositiva contenente il tessuto CNS è stata scansionata con un ingrandimento di 200X o superiore e non vengono rilevate inclusioni tipiche del virus. Campioni negativi mostrano corpi cellulari bluastre con poca o nessuna colorazione specifica nota.
Ogni persona che effettua test diagnostici sulla rabbia deve ricevere vaccinazioni standard pre-esposizione sulla rabbia e sottoporsi a una regolare valutazione degli anticorpi sierologici. Gli individui non immunizzati non dovrebbero entrare nelle aree in cui tale lavoro è in corso. Oltre alle precauzioni adottate quando si lavora con il virus della rabbia vivo, molti dei reagenti utilizzati nel test sono pericolosi.
Fare riferimento alle schede di dati di sicurezza per ogni reagente.
