РНК-связывающие белки имеют важное значение для клеточной физиологии. Важно отметить, что RBP высоко выражены во всем сперматогенеза и были хорошо документированы в качестве основных пост-транскриптионных регуляторов на всех стадиях зародышевых клеток. Определение обязательных целей имеет решающее значение для выяснения механистических ролей RBP.
Этот протокол представляет собой адаптированное применение метода eCLIP для захвата эндогенных прямых целей РНК и устанавливает применимую основу для eCLIP в яичках млекопитающих. Основным преимуществом этого метода является то, что он является нерадиоактивным, менее трудоемким и обеспечивает более сильное соотношение сигнала к шуму, поскольку соответствующий по размеру вход будет служить подходящим фоном для подлинных целей. Наконец, мы считаем, что мелкомасштабное секвенирование подкленонов полезно для следовать глубокому секвенированию.
Демонстрацией процедуры будет Сюй Цзюши, мой коллега. Чтобы начать эту процедуру, собрать около 100 миллиграммов яицы от мышей соответствующего возраста для каждого эксперимента иммунопреципиентации. Поместите ткани в ледяной PBS.
Используя пару пинцетов с тонкой наконечником, аккуратно удалите туника альбугинеа. Добавьте три миллилитров ледяного PBS в тканевую мясорубку и используйте рыхлый стеклянный пестик для тритурации ткани легкой механической силой. Затем перенесите подвеску ткани в блюдо клеточной культуры и добавьте ледяной PBS до шести миллилитров.
Встряхните тарелку быстро так, чтобы жидкость равномерно покрывала дно блюда. Перекрестный подвес на льду три раза с 400 миллиджоулей на сантиметр в квадрате на 254 нанометров. Убедитесь в том, чтобы смешать подвеску между каждым облучением.
Затем соберите подвеску в 15-миллилитровую коникатную трубку и центрифугу при 1200 раз г и при четырех градусах в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в один миллилитр PBS. После этого перенесите подвеску в 1,5-миллилитровую центрифугу.
Центрифуга при 1000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение двух минут, и отбросить супернатант. Во-первых, добавьте 125 микролитров белка магнитных бусин на образец в свежую центрифугу трубки. Поместите трубку на магнит, чтобы отделить бисер от раствора.
Через 10 секунд снимите супернатант и дважды вымойте бисер одним миллилитром ледяного лиза буфера. Повторное использование бисера в 100 микролитров холодного лиза буфера с 10 микрограммами антител eCLIP. Поверните трубки при комнатной температуре в течение 45 минут.
Затем дважды вымойте бисер одним миллилитром ледяного лиза буфера. Для начала, повторное использование гранул ткани в один миллилитр холодного лиза буфера, содержащего 22 микролитров 50x EDTA-бесплатный коктейль ингибитор белка и 11 микролитров ингибитора RNase. Продолжайте подсасывания образцов на льду в течение 15 минут.
Sonicate каждый образец, как указано в текстовом протоколе. Затем добавьте четыре микролитров DNase к каждой трубке и хорошо перемешайте. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут при встряхивании при 1200 об/мин.
После этого добавьте 10 микролитров разбавленного RNase и хорошо перемешайте. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут при встряхивании при 1200 об/мин. Затем центрифуга при 15 000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение 20 минут, чтобы очистить лисат.
Тщательно соберите супернатант и сохраните входные образцы для образцов RWB и RRI. Во-первых, добавить один миллилитр ликата в подготовленные бусы, и повернуть образцы на четыре градуса по Цельсию в течение двух часов или на ночь. После этого соберите бисер с магнитной подсвеми и отбросьте супернатант.
Вымойте бисер дважды с 900 микролитров высокосоленого буфера, а затем мыть бисер дважды с 900 микролитров мыть буфера. Затем, мыть бисер один раз с 500 микролитров 1x дефосфорилирования буфера. Во-первых, отказаться от супернатанта, и использовать тонкие советы пипетки, чтобы удалить любые остаточные жидкости.
Добавить 25 микролитров три премьер перевязки мастер смеси для каждого образца, и тщательно пипетки для смешивания. Добавьте в каждый образец 2,5 микролитров РНК-адаптера X1A и 2,5 микролитров РНК-адаптера X1B. Тщательно смешайте путем пипетки или стряхивая.
Инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение 75 минут, убедившись, что Флик трубки смешивать каждые 10 минут. Вымойте бисер один раз с 500 микролитров холодного буфера мытья. Далее, мыть бисер один раз с 500 микролитров холодного высокосоленого буфера, а затем с 500 микролитров холодного буфера мытья.
Повторите оба эти моет еще раз. Магнитно отделить бисер, и использовать тонкие советы пипетки, чтобы удалить любые остаточные жидкости. Resuspend шарики в 100 микролитров холодного буфера мытья, и переместить 20 микролитров в новые трубки, как образцы RWB.
Добавьте 7,5 микролитров буфера образца 4x LDS и три микролитера 10x образца, уменьшающие агент, к остальным образцам. Инкубировать при 70 градусах по Цельсию в течение 10 минут при встряхивании при 1200 об/мин. После этого, охладить образцы на льду в течение одной минуты, и центрифуга в 1000 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение одной минуты.
Для RWB гель, поместите трубки на магнит, и отделить белок элуат от бисера. Загрузите 15 микролитров образца в каждую колодец. Далее добавьте 500 микролитров антиоксиданта в 500 миллилитров 1x SDS бегущего буфера.
Вы запустите гель на 200 вольт, 1x SDS работает буфер в течение 50 минут или до тех пор, пока краситель фронт находится в нижней части. Передача белково-РНК-комплексов из геля в мембрану нитроцеллюлозы на 10 вольт в течение 70 минут в 1x буфер передачи с 10% метанола. Блокируйте мембрану RWB в 5%молоке при комнатной температуре в течение одного часа.
Промыть мембрану в TBST, и инкубировать с первичными антителами в TBST ночь на четыре градуса по Цельсию. После этого, мыть дважды с TBST, с каждой стирки продолжительностью пять минут. Инкубация вторичными антителами при ТБСТ при комнатной температуре в течение одного часа.
Затем, мыть мембрану три раза с TBST. Затем смешайте равные объемы буфера A и буфера B.Add этой смеси в мембрану и инкубировать в течение одной минуты. Обложка мембраны с полиэтиленовой пленкой, и подвергать его рентгеновской пленки при комнатной температуре в течение двух-трех минут до разработки пленки.
В этом исследовании, MOV10 eCLIP в яичках от взрослых диких мышей типа с RNase я лечения перекрестного лисата, целевой белок, который составляет около 114 килодальтонов, успешно обогащается. Результаты qPCR cDNA разбавленного от одного до 10 из различных образцов показывает, что не пересекаемые образцы показывают снижение восстановления РНК. Отмечается, что значения Ct не пересекаемой группы, как правило, в пять раз больше, чем УФ-перекрестные группы.
Здесь показаны репрезентативные результаты усиления ПЦР и выбора размеров с помощью электрофореза агарозного геля. Продукт грунтовка-димер появляется примерно на 140 базовых парах. Представление UCSC Genome Browser двух репрезентативных последовательностей субклеона показывает, что теги eCLIP, связанные с MOV10, находятся в пределах трехстандартного UTR гена Fto.
Ориентировочная скорость трех-премьер UTR целей составляет 75% соответствует большинству целей MOV10 в клетках HEK293 и в яичках. В отличие от этого, теги eCLIP, связанные с MOV10L1, расположены в кластере piRNA, что указывает на то, что MOV10L1 нацелен на прекурсоры piRNA. Примерная скорость целевых показателей прекурсоров пирНА составляет 42%, что отражает тенденцию предыдущих исследований.
MOV10L1 eCLIP с 40-единицей на миллилитр RNase I пищеварения дает относительно больше последовательностей с менее чем 20 базовых пар. Этот описанный здесь протокол представляет собой занятость метода eCLIP в воспроизводстве, области, в которой знания о взаимодействии РНК-РБП являются довольно недостаточными.
