Общая цель этого протокола заключается в измерении БК-полиомавирусной некодирующей области контроля, обусловленной транскрипционные активности путем измерения двойной флуоресцентных клеток с помощью цитометрии потока. БК-полиомавирус может вызывать тяжелые патологии у пациентов с ослабленным иммунитетом, особенно у реципиентов пересадки почек. Однако, поскольку высокоэффективный антивирус в настоящее время недоступен, необходимы методы измерения потенциального антивирусного воздействия других соединений.
Этот метод позволяет вирусологам анализировать влияние потенциальных противовирусных агентов, влияющих на транскрипционную активность БК-полиомавируса, обусловленную некодирующей областью контроля. Этот анализ позволяет также изучить влияние перестановок на активность промоутера по сравнению с архетипическими некодирующих контрольных регионов. Преимущество изучения вирусной активности промоутер с двойной флуоресценции доклад является то, что ранняя и поздняя экспрессия генов могут быть проанализированы в взаимно независимой манере.
Кроме того, трудная перфорация вирусных запасов и долгосрочные эксперименты по культуре инфекционных клеток не являются необходимыми, поскольку анализируются только трансфицированные и флуоресцентные клетки, а также изучаются препараты, снижающие жизнеспособность клеток и перфорацию. Этот протокол соответствует руководящим принципам человеческих исследований, утвержденным комитетом по этике медицинского факультета Университета Дуйсбурга-Эссена. Первым шагом является сбор образцов крови для изоляции полиомавирусной ДНК.
Соберите не менее трех миллилитров крови в трубках EDTA приобретения. Центрифуга образца на 2500 Г в течение 15 минут и пипетки плазмы в новую трубку. Приготовьте 40 микролитров белка SK в 1,5 миллилитровую микро-центрифугу и добавьте 400 микролитров плазмы путем пипетки.
Изолировать ДНК с помощью набора экстракции пятна ДНК, как описано в инструкциях производителя. Подготовь мастер-микс для предварительного ПЦР с помощью грунтовки пары А общим объемом 50 микролитров и используйте ранее изолированную ДНК. Распределите 45 микролитров мастер-микса в ПЦР-трубки.
Добавьте пять микролитров изолированной ДНК в трубки ПЦР и запустите ПЦР с условиями реакции, как показано в таблице 3. Повторите денатурацию и расширение в 35 циклов. Для вложенных приложений используйте грунтовую пару B, укрывая сайты ограничений для клонирования.
Смешайте 10 микролитров продукта ПЦР с двумя микролитров шестикратного гелеобразного красителя. Загрузите 10 микролитров смеси на гель 1.5%agarose и запустите гель в течение 30 минут при 60 миллиампере. Визуализуйте гель с помощью соответствующей уф-системы документации.
Очистите ПЦР-ампликонов с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Усваивается очищенные ампликоны с ферментами ограничения индикатора в течение двух часов при 37 градусах Цельсия. Повторите шаги очистки для очистки переваренных ампликонов.
Параллельно, также переварить плазмидный позвоночник. Проанализируйте переваренный плазмидный хребет на 0,8% низкого крепления агарозного геля. Не запускать гель при более высоком токе, чем 40 миллиампер.
Визуализуйте фрагменты ДНК с помощью длинноволнового УФ-излучения и вырежьте изогнутый позвоночник с помощью чистого скальпеля. Избегайте длительного времени УФ-облучения, чтобы предотвратить повреждение ДНК. Забор для фрагмента фломель геля в новую 1,5 миллилитровую микро-центрифугу трубки.
Нагрейте позвоночник, содержащий низкий режим агарозы кусок в течение 10 минут при температуре 65 градусов по Цельсию для того, чтобы расплавить гель кусок и смешивать каждые две минуты нежным вихрем. Расплавленный гель может быть непосредственно использован для перевязки. Лигат позвоночника и переваренный ампликсон с использованием T4 ДНК лигазы ночь при 16 градусов по Цельсию.
После стандартной процедуры клонирования изолируйте ДНК плазмы. Выполните ограничение пищеварения фермента, чтобы проверить положительные клоны и визуализировать переваренные фрагменты на 1%agarose гель. Семя 100 000 HEK293T клеток на колодец 12 пластины хорошо 24 часов до трансфекции и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию, поддерживать активное распространение во время трансфекции.
Клетки должны быть примерно на 80%слияние при трансфекции. Поместите 250 микролитров уменьшенных средств сыворотки в стерильную трубку и добавьте по одному микрограмму каждой зарегистрированной плазменной ДНК и аккуратно перемешайте с помощью пипетки. Добавьте три микролитров трансфектного реагента в смесь ДНК и аккуратно перемешайте трубами и инкубировать в течение 15 минут при 22 градусах Цельсия.
Добавить смесь, падение мудрый колодец и аккуратно распределить в колодец. Через четыре часа замените супернатант свежей средой, содержащей испытательные агенты и растворителя. В этом примере были использованы ингибиторы мТОР INK-128 и рапамицин.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию до анализа. Проверьте клетки на наличие красной и зеленой флуоресценции под микроскопом флуоресценции. Красная и зеленая флуоресценция соответствуют ранней и поздней экспрессии гена БК-полиомавируса соответственно.
72 часа после трансфекции, тщательно стремитесь к супернатанту. Вымойте клетки дважды с одним миллилитров холодного PBS. Аккуратно добавьте 500 микролитров трипсина и поверните пластину немного, чтобы избежать преждевременного отслоения клеток.
Этот шаг имеет важное значение, чтобы избежать дублетов клеток. После добавления, трипсин удаляется непосредственно с той же наконечником пипетки. Инкубировать клетки, по крайней мере пять минут при 37 градусов по Цельсию.
Повторно приостановить трипсин S клетки с одним миллилитром PBS, содержащий 3%FCS и передачи подвески в предварительно помеченных facS труб. Добавьте DAPI при концентрации одного микрограмма на миллилитр до анализа FACS. Анализируйте клетки с помощью цитометра потока.
Для каждого образца, мера по крайней мере 10000 живых клеток. Первоначальная компенсация имеет важное значение для различения красных и зеленых сигналов для достижения точных результатов. Регент управления, не связанный с кодированием, был усилен с помощью вложенного протокола ПЦР с использованием внутренней грунтовки, которая укрывает места ограничения для клонирования.
Проверка ампликона проводилась с помощью электрофорезов агарозового геля, в то время как ампликоны, полученные из архетипических последовательностей NCCR при однородном распределении размеров в геле, полученные из перестроенных NCCRs с вставками и удалениями, отличались по размеру. Выбор положительных клонов, содержащих NCCR, был проверен анализом ограничений. Область малых космических пространств была заменена более крупными фрагментами NCCR, указывающими на положительные клоны.
Плазмидная ДНК, выделенная из проверенных клонов, была отправлена на пирозекку. В этом примере было обнаружено удаление в P-блоке и замена в O-блоке. Клетки HEK293T были временно трансфицированы с уважением к отчетной конструкции, а активность NCCR контролировалась с помощью микроскопии флуоресценции.
Красные и зеленые флуоресцентные лампы соответствовали ранней и поздней экспрессии гена БК-полиомавируса соответственно. Первый NCCR показал сильную позднюю экспрессию генов, в то время как второй пример имел сравнительно сильную раннюю, но умеренную позднюю экспрессию генов. Отрицательные ячейки DAPI были закрыты, и был создан точечный сюжет, показывающий eGFP против tdTomato.
Образцы, которые были отрицательными, а также положительные только для tdTomato или eGFP были включены в анализ. Средние интенсивности флуоресценции были получены от каждого клона тестирования. В этом примере, лечение с двойным ингибитором mTOR INK128 значительно сократило tdTomato МФО, что означает, что раннее выражение было ингибировано.
Этот метод позволяет определить используемые в настоящее время и другие соединения для обнаружения БК-полиомавируса с помощью транскрипционные действия. В ранней экспрессии генов, это решительно определяет вирусный подтекст. Ингибиторные капли могут рассматриваться как агенты для пациентов с ослабленным иммунитетом в случае реактивации БК-полиомавируса.
