A principal vantagem deste ensaio é a simplicidade e a precisão, pois não requer um embrião enxaguar para transferir para o frasco de alimentos e que evita perdas de erros técnicos. Este protocolo não requer habilidades técnicas especializadas. No entanto, o tempo adequado e a transferência cuidadosa de água são importantes para sua precisão e reprodutibilidade.
Demonstrando este procedimento estará Antonio Rockwell, um recém-formado doutorando do meu laboratório. Antes de iniciar o procedimento, despeje o ágar de uva em uma placa de Petri de 35 milímetros a meio cheio e deixe o ágar solidificar por uma hora. Quando o ágar se solidificar, use uma pequena faca de plástico para coçar suavemente a superfície do ágar ao redor da parte externa da placa, deixando o meio da placa livre de arranhões.
Em seguida, coloque uma pequena quantidade de pasta de levedura recém-preparada no centro do prato e coloque o prato em uma mini gaiola de coleta de embriões. Para a coleta de embriões, primeiro coloque duas fêmeas virgens de Drosophila e um jovem macho dentro da gaiola de coleta por 24 horas. No dia seguinte, inspecione o fundo da placa de ágar para procurar embriões.
Se os embriões tiverem sido colocados, transfira a placa de ágar para uma câmara úmida e cubra a placa com a tampa para evitar a desidratação. Se vários dias de colocação forem marcados, coloque uma nova placa de ágar na gaiola de coleta. Use o microscópio para determinar o número de embriões eclodidos e larvas L1, e devolva os embriões à câmara úmida à temperatura ambiente até que todos os embriões tenham eclodido e desenvolvido em larvas L1.
Após 48 horas, conte o número de embriões eclodidos e larvas L1 e use uma espátula para remover cuidadosamente o disco de ágar de uva da placa de Petri, colocando o disco L1 lado para baixo sobre a comida em um frasco de alimentos grande o suficiente para acomodar o disco. Em seguida, inspecione cuidadosamente a placa de Petri para obter qualquer larva restante. Monitore o frasco de alimentos diariamente aproximadamente ao mesmo tempo todos os dias para confirmar que as larvas L2 e L3 podem ser observadas indo para a comida.
Registo o número de pupas e Drosophila adulto, continuando a contar até que não sejam observados mais adultos e evitando contar a geração subsequente. Em seguida, faça uma análise qui-quadrado. A hipótese nula pressupõe uma viabilidade 100%, de tal forma que o número de adultos será igual ao número de embriões eclodidos e L1 originalmente registrados e transferidos para os frascos de alimentos.
Quando o ágar é colocado na lateral do frasco, muitos dos embriões e larvas não amadurecem para adultos, provavelmente devido à desidratação do disco de ágar da uva. Quando o ágar de uva é colocado de frente para baixo dentro do frasco em contato direto com a superfície alimentar, menos de 6% da prole é tipicamente perdido, pois o ágar permanece hidratado enquanto em contato com a umidade do alimento instantâneo dentro do frasco. Neste experimento representativo comparando o desenvolvimento de progênero selvagem e mutante, aproximadamente 91% da prole mutante amadureceu até a idade adulta usando este método em comparação com 94% da descendência de moscas selvagens.
Lembre-se de transferir o embrião do disco de ágar para baixo no frasco de alimentos e, em seguida, para verificar a placa de Petri vazia para qualquer larva restante que não foi transferida. Outro passo crucial é transferir o disco de ágar para um frasco de alimentos no máximo 48 horas depois de remover a placa de ágar de uva das mini gaiolas de coleta de embriões para evitar a desidratação.
