このアッセイの主な利点は、胚のすすがりを食品バイアルに移す必要がないため、技術的な誤りによる損失を回避するため、シンプルさと精度です。このプロトコルは、専門的な技術スキルを必要としません。しかし、適切なタイミングと慎重な水の移動は、その精度と再現性のために重要です。
この手順を実証することは、アントニオ・ロックウェル、私の研究室から最近卒業した博士課程の学生になります。手順を開始する前に、35ミリメートルのペトリ皿にブドウ寒天を半分に注ぎ、寒天が1時間固まるようにします。寒天が固まったら、小さなプラスチックナイフを使ってプレートの外側の周りの寒天の表面を優しく傷つけ、プレートの真ん中に傷を残します。
その後、少量の作りたての酵母ペーストを皿の中央に入れ、皿を胚コレクションミニケージに入れます。胚コレクションの場合、最初の場所2つの処女ショウジョウバエの女性と24時間コレクションケージ内の1人の若い男性。翌日、寒天プレートの底部を検査して胚を探します。
胚が敷設されている場合は、寒天プレートを湿気の多いチャンバーに移し、脱水を避けるために蓋でプレートを覆います。敷設の数日が得点される場合は、コレクションケージに新しい寒天プレートを配置します。顕微鏡を使用して、孵化した胚とL1幼虫の数を決定し、すべての胚が孵化してL1幼虫に発達するまで、胚を室温で湿気の多いチャンバーに戻します。
48時間後、孵化した胚とL1幼虫の数を数え、スパチュラを使用してペトリ皿からブドウ寒天のディスクを慎重に取り除き、ディスクを収容するのに十分な大きさの食品バイアルにディスクL1側を置きます。その後、ペトリ皿に残りの幼虫がないか慎重に検査します。毎日ほぼ同じ時間に毎日食品バイアルを監視し、L2とL3の幼虫が食べ物に向かうのを観察できることを確認します。
子犬と成人ショウジョウバエの数を記録し、成人が観察されなくなるまで数え続け、その後の世代を数えることを避ける。次にカイ二乗解析を実行します。帰無仮説は、成人の数がもともと記録され、食品バイアルに移される孵化胚とL1の数に等しくなるように、100%生存率を仮定します。
寒天がバイアルの側面に置かれると、胚および幼虫の多くは、ブドウ寒天ディスク脱水のために成人に成熟しない。ブドウ寒天が食品表面に直接接触してバイアル内に伏せに置かれると、寒天がバイアル内のインスタント食品の水分に接触している間、水分補給されたままであるため、子孫の6%未満が通常失われます。この代表的な実験では、野生型と変異体の子孫を比較した、変異体の子孫の約91%は、野生型ハエからの子孫の94%と比較して、この方法を使用して成人期に成熟した。
寒天ディスクの胚側を食品バイアルに移し、その後、移されなかった残りの幼虫がないか空のペトリ皿をチェックすることを忘れないでください。もう一つの重要なステップは、脱水を防ぐために胚採取ミニケージからブドウ寒天プレートを取り除いた後、遅かれ早かれ寒天板を食品バイアルに移す。
