Bu protokol, eşleştirilmiş hasta türetilmiş ksinograftlar veya PDX ve buna karşılık gelen hasta türevi organoid çizgilerinden oluşan eşleştirilmiş bir kitaplık oluşturmak için kullanılabilir. Bu yöntemin avantajı, in vitro tarama için PDX kullanarak organoid oluşturmak için kullanılabilmesidir, bu da eşleşen in vivo / in vitro model çiftleri ile sonuçlanır. Tümörleri toplayarak ve metin el yazmasında açıklandığı gibi dokuyu işleyerek başlayın.
Doku sindirimi sonrası, beş mililitre steril plastik pipet ile dokuyu yukarı ve aşağı pipet. Daha sonra homojenliğe 20 mililitre AD + ekleyin ve 100 mikrometre hücre süzgeci ile filtreleyin. Filtratı AD+ ile iki kez yıkayın, ardından plastik bir tüpe aktarın ve beş dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyin.
BME'deki hücreleri yeniden biriktirin ve buzda tutun. Organoid kültürünü hazırlamak için, hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini altı kuyulu bir plakanın her kuyusuna aktarın ve plakayı 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Her kuyuya iki mililitre organoid ortam ekleyin ve temsilcinin mikroskop altında düştüğünü görüntüleyin.
Organoid kültürlerini 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte, her üç ila dört günde bir orta değişikliklerle ve her yedi günde bir-iki oranında geçişle koruyun. Organoidleri ayrıştırtıktan sonra, 70 mikrometrelik bir filtreden 50 mililitrelik plastik bir tüpe geçirin. Organoidleri mikroskop altında sayın ve %5'lik son konsantrasyon için bme'de buz üzerinde yeniden depolayın Her 384 kuyu plakasına 50 mikrolitre organoid süspansiyonu ekleyin ve kuyu başına 200 CR2110 PDBO tohumlama yoğunluğu için sıvı bir dağıtıcı ile ekleyin.
Seri seyreltmede her kuyuya SN38 eklemek için dijital dağıtıcıyı kullanın. Dijital dağıtıcı yazılım aracını kullanarak bir plaka haritası oluşturun. Tedaviler% 100 canlılığa sahip negatif kontrol aracını ve% 0 canlılığa sahip beş mikromolar Staurosporine pozitif kontrolünü içermelidir.
Bittiğinde, ilaçla tedavi edilen 384 kuyu plakasını 37 santigrat derece inkübatöre geri yerleştirin. Hafif mikroskopi altında PDXO CR2110, pdx türevi organoidler ile hasta kaynaklı organoidler arasındaki benzerliği gösteren tipik kistik morfolojiyi aynı kültür koşullarında göstermektedir. H&E boyama ile yapılan histopatolojik inceleme, PDXO CR2110'un doku yapılarının ve hücre tiplerinin orijinal PDX CR2110 ile benzer olduğunu ortaya koymaktadır.
PDX ve PDXO'nun genomik profil karşılaştırmaları transkriptom ekspresyonunun %94,92 korelasyonunu ve DNA mutasyonlarının %97,67'sini göstererek bu model çifti arasında genel bir genomik benzerlik olduğunu göstermektedir. PDXO CR2110'da 384 kuyu plakasında uyuşturucu duyarlılığı tahlilleri yapıldı. PDXO CR2110, PDX tedavi sonuçlarına uygun olarak irinotekan duyarlı ve cisplatine karşı dirençliydi.
Eşleşen in vitro ve in vivo modelleri, in vitro tarama ve in vivo doğrulama için birbirlerine iltifat edebilir, ilaç keşfinin başarı oranını iyileştirir ve klinik gelişimde yıpratma oranlarını potansiyel olarak azaltabilir.
