Este protocolo se puede utilizar para establecer una biblioteca emparejada de xenoinjertos paciente-derivados apareados, o PDX, y de líneas organoides paciente-derivadas correspondientes. La ventaja de este método es que se puede utilizar para crear organoides utilizando PDX para el cribado in vitro, lo que resulta en pares emparejados de modelos in vivo / in vitro. Comience por cosechar los tumores y procesar el tejido como se describe en el manuscrito del texto.
Después de la digestión del tejido, pipetee el tejido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de plástico estéril de cinco mililitros. Luego agregue 20 mililitros de AD + al homogeneado y filtre con un colador celular de 100 micrómetros. Lave el filtrado dos veces con AD+, luego transfilázquelo a un tubo de plástico y centrífugalo a 450 veces G durante cinco minutos.
Resuspend las células en BME y mantenerlas en el hielo. Para preparar el cultivo organoide, transfiera 200 microlitros de la suspensión celular a cada pozo de una placa de seis pozos e incube la placa a 37 grados Centígrados durante 30 minutos. Agregue dos mililitros de medios organoides a cada pozo e imagen del representante cae bajo un microscopio.
Mantener los cultivos organoides a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono con cambios medios cada tres a cuatro días y pasar en una proporción de uno a dos cada siete días. Después de disociar los organoides, ejecutarlos a través de un filtro de 70 micrómetros en un tubo de plástico de 50 mililitros. Cuente los organoides bajo un microscopio y resuspend ellos en BME en el hielo para una concentración final del 5%Agregue 50 microlitros de la suspensión organoide en cada placa de 384 pozos con un dispensador líquido para una densidad de siembra de 200 CR2110 PDXOs por pozo.
Utilice el dispensador digital para añadir SN38 a cada pozo en dilución en serie. Cree un mapa de placas utilizando la herramienta de software dispensador digital. Los tratamientos deben incluir un vehículo de control negativo con viabilidad al 100% y control positivo de cinco estaurosporinasporas micromolares con viabilidad al 0%.
Cuando haya terminado, coloque las placas de 384 pozos tratadas con drogas de nuevo en la incubadora de 37 grados Celsius. Bajo microscopia ligera, PDXO CR2110 demuestra la morfología enquistada típica que demuestra la semejanza entre los organoids PDX-derivados y los organoids paciente-derivados bajo mismas condiciones de la cultura. La examinación histopatológica por la coloración de H&E revela que las estructuras del tejido y los tipos de la célula de PDXO CR2110 son similares al PDX original CR2110.
Las comparaciones de perfiles genómicos de PDX y PDXO demuestran una correlación del 94,92% de la expresión del transcriptoma y una concordancia del 97,67% de las mutaciones del ADN, lo que sugiere una similitud genómica general entre este par de modelos. Los análisis de la sensibilidad de la droga fueron realizados en PDXO CR2110 en las placas de 384 pozos. PDXO CR2110 era sensible al irinotecan y resistente al cisplatin, constante con resultados del tratamiento de PDX.
El par emparejado de modelos in vitro e in vivo puede complementarse entre sí para la detección in vitro y la validación in vivo, mejorando la tasa de éxito del descubrimiento de fármacos y reduciendo potencialmente las tasas de deserción en el desarrollo clínico.
