Dieses Protokoll kann verwendet werden, um eine übereinstimmende Bibliothek von gepaarten patientenabgeleiteten Xenografts (PDX) und entsprechenden vom Patienten abgeleiteten Organoidlinien zu erstellen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass sie zur Herstellung von Organoiden mit PDX für das In-vitro-Screening verwendet werden kann, was zu übereinstimmenden Paaren von In-vivo/In-vitro-Modellen führt. Beginnen Sie mit der Ernte der Tumoren und der Verarbeitung des Gewebes, wie im Textmanuskript beschrieben.
Nach der Gewebeverdauung das Gewebe mit einer sterilen Kunststoffpipette von fünf Millilitern auf und ab pipetten. Dann 20 Milliliter AD+ in das Homogenat geben und mit einem 100 Mikrometer Zellsieb filtrieren. Waschen Sie das Filtrat zweimal mit AD+, geben Sie es dann in ein Kunststoffrohr und zentrifugieren Sie es fünf Minuten lang bei 450 mal G.
Resuspendieren Sie die Zellen in BME und halten Sie sie auf Eis. Um die Organoidkultur vorzubereiten, 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte geben und die Platte bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten inkubieren. Fügen Sie zwei Milliliter organoider Medien zu jeder Vertiefung hinzu und stellen Sie die repräsentativen Tropfen unter einem Mikroskop ab.
Halten Sie die Organoidkulturen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit Mediumswechseln alle drei bis vier Tage und Passage im Verhältnis von eins zu zwei alle sieben Tage. Nachdem Sie die Organoide dissoziiert haben, führen Sie sie durch einen 70-Mikrometer-Filter in ein 50-Milliliter-Kunststoffrohr. Zählen Sie die Organoide unter einem Mikroskop und resuspendieren Sie sie in BME auf Eis für eine Endkonzentration von 5%Fügen Sie 50 Mikroliter der Organoidsuspension in jede 384-Well-Platte mit einem Flüssigkeitsspender für eine Aussaatdichte von 200 CR2110 PDXOs pro Vertiefung hinzu.
Verwenden Sie den digitalen Spender, um SN38 in serieller Verdünnung zu jeder Vertiefung hinzuzufügen. Erstellen Sie eine Plattenkarte mit dem Software-Tool für digitale Spender. Die Behandlungen sollten ein Negativkontrollvehikel mit 100% Lebensfähigkeit und eine Positiveinleitung von fünf mikromolaren Staurosporinen mit 0% Lebensfähigkeit umfassen.
Wenn Sie fertig sind, legen Sie die mit Medikamenten behandelten 384-Well-Platten wieder in den 37-Grad-Celsius-Inkubator. Unter Lichtmikroskopie zeigt PDXO CR2110 eine typische zystische Morphologie, die die Ähnlichkeit zwischen PDX-abgeleiteten Organoiden und patientenabgeleiteten Organoiden unter den gleichen Kulturbedingungen zeigt. Die histopathologische Untersuchung durch H&E-Färbung zeigt, dass die Gewebestrukturen und Zelltypen von PDXO CR2110 dem ursprünglichen PDX CR2110 ähneln.
Genomische Profilvergleiche von PDX und PDXO zeigen eine Korrelation von 94,92% der Transkriptomexpression und eine 97,67%ige Übereinstimmung von DNA-Mutationen, was auf eine allgemeine genomische Ähnlichkeit zwischen diesem Modellpaar hindeutet. Arzneimittelsensitivitätstests wurden an PDXO CR2110 in 384-Well-Platten durchgeführt. PDXO CR2110 war empfindlich gegenüber Irinotecan und resistent gegen Cisplatin, was mit den PDX-Behandlungsergebnissen übereinstimmt.
Das aufeinander abgestimmte Paar von In-vitro- und In-vivo-Modellen kann sich gegenseitig für das In-vitro-Screening und die Validierung in vivo ergänzen, die Erfolgsrate der Arzneimittelentdeckung verbessern und möglicherweise die Fluktuationsraten in der klinischen Entwicklung reduzieren.
