Этот метод может помочь решить ключевые проблемы в области вирусологии и микробиологии, связанные с перечислением бактериофагов из сложных образцов и бактериофаг на основе диагностики и терапии. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет время эффективной и точной количественной оценки большого количества образцов из фагов дисплей биопанирования экспериментов не представляется возможным с традиционными анализами. Демонстрация процедуры будет Рашми Mohanty и Jasmim Leal, аспиранты из моей лаборатории.
После проектирования грунтовок и создания концентрации запасов, получить ссылку T7 фаг ДНК в концентрации 0,1 микрограмма на микролитер. Используя ультрапурную воду, последовательно разбавляйте эту ДНК в десять раз, от одного миллиона фемтограмм на микролитр до одной фемтограммы на микролитр в 0,2 миллилитровЫх ПЦР-трубках. Подготовка 20 микролитров каждой концентрации, убедившись, что изменить пипетки советы и вихрь труб между каждой стадии разбавления.
Затем переобразуйте концентрацию ДНК phage T7 из фемтограмм на микролитер в копии генома на микролитер. Во-первых, пипетка 200 микролитров образца клона мага T7 в 1,5 миллилитровую микро центрифугу трубки для каждого из 10 желаемых образцов. Добавьте два микролитров DNase по одному к каждой трубке.
Крышка трубки и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут в нагретой сухой ванне. Затем инкубировать при 100 градусах по Цельсию в течение 15 минут в нагретой сухой ванне. Центрифуга трубок, содержащих теплообработанные фаги на 18, 534 раз г в течение 10 секунд.
Поместите центрифугированные трубки на вихревой смеситель, установленный в режиме сенсорной активации в течение 10 секунд, чтобы смешать фаги. Спин снова на 18, 534 раз г в течение 10 секунд. После этого оставьте образцы на лабораторной скамейке около часа, чтобы охладить их до комнатной температуры.
Подготовь премикс qPCR для 10 биопаннефных фагов неизвестных концентраций и семь образцов стандартных концентраций в трипликате. В результате получился премикс для 51 образца, содержащий 255 микролитров мастер-микста qPCR, 51 микролитров грунтовки и 102 микролитров воды. Aliquot восемь микролитров подготовленной смеси ПЦР в 51 скважины 96-хорошо qPCR пластины.
Затем добавьте два микролитров теплообработанных образцов T7 фагов к каждой из этих скважин, раздав их под поверхностью премикса qPCR. Используя клейую пленку, запечатайте пластину. Оберните пластину в алюминиевую фольгу, чтобы свести к минимуму отбеливание флуоресценции фото, а затем приступить к запуску пластины на оборудовании qPCR.
Настройка условий езды на велосипеде и настройки кривой расплава, изложенные в текстовом протоколе. После запуска qPCR из необработанных данных анализируются участок усиления, участок кривой расплава и многокомпонентный участок. Участок усиления указывает, является ли усиление ПЦР каждой выборки успешным или нет.
Многокомпонентный сюжет представляет собой усиление и распад флуоресцентного сигнала на протяжении всех циклов усиления. В то время как участок кривой расплава используется для проверки специфичности грунтовки, так как каждый продукт ПЦР имеет одну уникальную температуру плавления. Стандартная кривая затем генерируется из эталонной ДНК.
Здесь эффективность усиления рассчитывается в размере 92,4% Репрезентативные данные исследования qPCR затем сравниваются с тем же фагом, который был количественно с помощью анализа двухслойного налета в тестемом диапазоне от 10 до 10 миллионов копий генома на микролитр. Как видно здесь, количество фагов в количественной оценке qPCR выше, чем в анализе бляшек. Повторяемость метода qPCR, представленного коэффициентом дисперсии, имеет значения от 2,85 до 27,2% При попытке этой процедуры важно помнить, что при разработке и использовании qPCR существует множество соображений для точной количественной оценки фагов, включая тщательную обработку и подготовку образцов и калибровку соответствующего оборудования.
Следуя этому методу, другие методы могут быть выполнены для того, чтобы перечислить фагов частиц в различных приложениях, включенных в vivo биопанирования, фаг библиотеки ДНК подготовки и следующего поколения секвенирования и обнаружения фагов в сложных экологических образцов. Не забывайте, что фагов считаются биологическими опасностями в лаборатории и такие меры предосторожности, как средства индивидуальной защиты, в том числе перчатки и лабораторные пальто, всегда следует носить во время выполнения процедуры.
