Этот протокол помогает проверить существование Wolbachia в клетках, что является основой понимания взаимодействия между Wolbachia и ее хозяином. В этом протоколе были использованы четыре метода для успешного выявления внутриклеточной инфекции Wolbachia, что подтвердило и улучшило точность обнаружения инфекции Wolbachia в клетках. Продемонстрировать процедуру будет Цюцю Сяо, аспирант из Ключевой лаборатории современной биологии и характеристик патогенов.
Начните с наблюдения незапятнанных клеток Aa23 и Aa23-T при 100-кратном увеличении с помощью световой микроскопии. Культивируйте клетки в течение пяти-семи дней, чтобы достичь 70-80% слияния на колбу. С помощью пипетки переложить 1 мл питательной среды в микроцентрифужную трубку.
Центрифуга при 100 RCF в течение пяти минут для сбора клеток. Удалите супернатант и храните полученную ячейку гранулы при минус 20 градусах Цельсия. Культивируйте клетки в течение пяти-семи дней, чтобы достичь 90-100% слияния на колбу.
Повторно суспендируют гранулы в 0,40 мл PBS и переложат 50 микролитров этого раствора в микроцентрифужную трубку. Добавьте пять микролитров 20 мг/мл протеиназы К и инкубируйте при 55 градусах Цельсия в течение одного часа. Затем инкубируют трубки при 99 градусах Цельсия в течение 15 минут, чтобы получить сырую ДНК и хранить ее при минус 20 градусах Цельсия.
Для выполнения ПЦР готовят общую реакционную смесь из 20 микролитров и устанавливают условия ПЦР, как описано в тексте рукописи. Обнаружение ДНК на 1% агарозном геле с помощью гелевого тепловизора. Выполняйте количественную амплификацию ПЦР с использованием TB Green в системе ПЦР в режиме реального времени и записывайте результаты каждой реакции.
Проанализировать ДНК в общем объеме реакции 20 микролитров и установить количественные условия ПЦР, как описано в тексте рукописи. Рассчитайте количество копий генов WSP и RPS6 в клетках в соответствии с установленной стандартной кривой. Затем рассчитайте относительную плотность Wolbachia по числу копий wsp/RPS6.
Анализируйте данные с помощью независимых образцов t-теста. Добавьте 200 микролитров лизисного буфера в гранулу клетки и инкубируйте на льду в течение 30 минут. Центрифугируйте лизаты при 12 000 RCF в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия и аспирируйте супернатант.
Проанализируйте концентрацию супернатанта с помощью набора для анализа белка BCA, следуя инструкциям производителя. Загрузите равное количество белка на 15% гель SDS-PAGE. Переложите белок на нитроцеллюлозные мембраны и блокируйте мембраны 5% обезжиренным молоком в течение двух часов при комнатной температуре.
Затем трижды промыть мембраны ТБСТ. Инкубируйте мембраны в течение ночи при 4 градусах Цельсия со 100 микролитрами анти-wsp поликлонального антитела, полученного путем разбавления первичного антитела 5% обезжиренным молоком. Промыть первичное антитело три раза с помощью TBST.
Добавьте к мембранам 100 микролитров пероксидазно-конъюгированного вторичного антитела хрена и инкубируйте его на шейкере в течение одного часа при комнатной температуре. Трижды промыть мембраны TBST и смешать 20 микролитров раствора А и 20 микролитров раствора В в комплекте для детектирования хемилюминесценции в соотношении один к одному. Погрузите всю мембрану в люминесцентный раствор одновременно и наблюдайте за сигналами с помощью многофункциональной системы визуализации.
На лазерной конфокальной чашке Петри инкубируют ячейки Aa23 и Aa23-T в течение трех-четырех дней при температуре 28 градусов Цельсия под 5% атмосферного углекислого газа. Когда клетка достигнет 60-70% слияния, промыть клетки три раза PBS. Зафиксируйте клетки в одном мл 4%-го параформальдегида в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
Промывайте неподвижные ячейки с помощью PBST в течение пяти минут и дважды промывайте ячейки PBS. Инкубируйте чашку Петри в одном мл 3% бычьего сывороточного альбумина в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте 100 микролитров мышиного анти-wsp поликлонального антитела и мышиной сыворотки к слайдам и высиживайте его на ночь во влажной коробке при четырех градусах Цельсия.
Выньте чашку Петри из влажного ящика и верните ее к комнатной температуре. Вымойте их три раза с PBS и удалите PBS. Защитите следующие процедуры от света.
Инкубируйте чашку Петри со 100 микролитрами конъюгированного козьего антимышьего антитела Alexa Fluor 488 при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Инкубируйте образец чашки Петри с 50 микролитрами DAPI, разведенными в PBS до 10 мкг/мл при 37 градусах Цельсия в течение пяти минут, а затем трижды промывайте их PBS. Наблюдайте за иммуноокрашиванием под конфокальным микроскопом.
До обнаружения Wolbachia клетки Aa23 и Aa23-T наблюдались под световым микроскопом для определения морфологических различий между двумя клеточными линиями. Клетки Aa23 и AA23-T имели, по крайней мере, две морфологии клеток, но между двумя типами клеток не наблюдалось никаких явных морфологических различий. С помощью диагностических праймеров 81F/691R положительная амплификация гена Wolbachia wsp была обнаружена в клетках Aa23, но не в Aa23-Т-клетках.
Анализ плотности Wolbachia в клеточных линиях показал соотношение wsp/rps6 2,4 в клетках Aa23, но отсутствие Wolbachia в клетках Aa23-T. Вестерн-блоттинговый анализ белковых экстрактов показал сильный сигнал wsp для Aa23, но сигнал не был обнаружен для Aa23-T. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ обнаружил белок wsp в клетках Aa23, в то время как только ОКРАШЕННАЯ DAPI ДНК была обнаружена в Aa23-T-клетках.
Убедитесь, что колбы для культивирования инкубированы при температуре 28 градусов цельсия ниже 5% атмосферного углекислого газа в течение пяти-семи дней. За этой процедурой может последовать электронная микроскопия, где необходимо уделить особое внимание пробоподготовке и секционированию. Четыре экспериментальных метода, использованных в этом исследовании, подтвердили точность обнаружения инфекции Wolbachia в клетках, что также применимо к другим типам клеток и тканей.
