Этот протокол описывает новый метод доставки пероральных комбинированных антиретровирусных препаратов, или АРТ, который успешно подавляет репликацию РНК ВИЧ у гуманизированных мышей. Новый пероральный метод АРТ превосходит предыдущие попытки доставки благодаря своей безопасности, простоте подготовки и введения, а также снижению стресса животных в результате ежедневной инъекции. Предлагаемый метод пероральной доставки для подавления репликации РНК ВИЧ у гуманизированных мышей будет очень ценным для доклинических исследований по разработке новых методов лечения, которые точно имитируют доставку лекарств у хронических ВИЧ-инфицированных людей.
Продемонстрировать процедуру будет Валери Резак, заведующая лабораторией и техник из нашей лаборатории. Начните с взвешивания отдельных препаратов. Сделайте 10 пищевых стаканчиков с cART, используя стерильные клеточные скребки, чтобы взвесить 250 миллиграммов FTC, 375 миллиграммов TDF и 500 миллиграммов RAL или ELV в отдельные стерильные 50-миллилитровые центрифужные трубки в шкафу биобезопасности.
Добавьте DMSO в трубку FTC и TDF, чтобы составить конечную концентрацию 250 миллиграммов на миллилитр, и в трубку RAL или ELV до конечной концентрации 500 миллиграммов на миллилитр. Смешайте раствор препарата путем перемешивания и пипетирования до получения прозрачного раствора. Стерилизуйте растворы с помощью 0,22-микрометрового гидрофильного мембранного фильтра PVDF со стерильным шприцем.
Отдельные лекарственные растворы можно хранить при минус 20 градусах Цельсия в течение 12 недель. Только что разморозьте по одной аликвоте каждого раствора препарата перед применением при 37 градусах Цельсия до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Хорошо перемешать с помощью пипетки.
Смешайте препараты, растворенные в ДМСО, и хорошо перемешайте, чтобы получить мастер-микс, содержащий один миллилитр FTC, 1,5 миллилитра TDF и один миллилитр ELV или RAL. Добавьте 350 микролитров раствора cART master mix в чашку, чтобы приготовить одну чашку диетического геля для повышения cART. Добавьте в чашку 0,75 миллилитра триметоприма сульфаметоксазола.
Тщательно перемешайте, используя одномиллилитрные стерильные наконечники пипетки. Используя наконечник пипетки, аликвотируйте чашку с пищей, содержащую cART, на 60-миллиметровую чашку Петри. Рассчитайте количество cART в чашке с пищей, взвесив пищу для каждой клетки в соответствии с количеством мышей.
Выньте обычный чау из клетки и замените его чашкой с пищей, содержащей cART. Обновляйте пищу cART три раза в неделю. Взвешивайте использованные чашки для контроля потребления.
Затем взвешивайте мышей еженедельно, чтобы подтвердить потребление. После четырех недель заражения ВИЧ-1 мышей лечили еще 7,5 недель, либо схемой FTC/TDF/RAL через подкожную инъекцию, либо пероральным введением FTC/TDF/RAL или FTC/TDF/ELV. Вес мышей постоянно снижался во время ежедневной подкожной инъекции кАРТ.
Напротив, диетический гель восстанавливал вес мышей до уровня до начала АРТ после пяти недель перорального приема кАРТ. Кроме того, не наблюдалось значительных изменений веса между группами RAL или ELV. В течение четырех недель режим питания FTC/TDF/ELV и RAL/ART подавлял репликацию вируса на 100% и 80% соответственно.
70% мышей, получавших инъекцию SC, достигли неопределяемых уровней после четырех недель лечения. Результаты подтвердили, что пероральное введение подавляло репликацию вируса быстрее и эффективнее, чем подкожные инъекции. Кроме того, режим питания cART предотвращал дальнейшее снижение соотношения CD4 к CD8 в периферической крови раньше, чем ежедневные инъекции.
Крайне важно поддерживать стерильность любого материала, участвующего в протоколе, в течение всего процесса и избегать многократного замораживания и оттаивания раствора запасов cART.
