Questo protocollo descrive un nuovo metodo per somministrare farmaci antiretrovirali combinati orali, o ART, che sopprime con successo la replicazione dell'RNA dell'HIV nei topi umanizzati. Il nuovo metodo ART orale supera i precedenti tentativi di consegna grazie alla sua sicurezza, facilità di preparazione e somministrazione e ridotto stress animale derivante da un'iniezione giornaliera. Il metodo di somministrazione orale proposto per sopprimere la replicazione dell'RNA dell'HIV nei topi umanizzati sarà molto prezioso per studi preclinici proof-of-concept per sviluppare nuovi trattamenti di cura che imitino da vicino la somministrazione del farmaco in individui cronici con infezione da HIV.
A dimostrare la procedura sarà Valerie Rezak, responsabile di laboratorio e tecnico del nostro laboratorio. Inizia pesando i singoli farmaci. Prepara 10 bicchieri alimentari con cART utilizzando raschietti per cellule sterili per pesare 250 milligrammi di FTC, 375 milligrammi di TDF e 500 milligrammi di RAL o ELV in singoli tubi da centrifuga sterili da 50 millilitri in un armadio di biosicurezza.
Aggiungere DMSO al tubo FTC e TDF per ottenere una concentrazione finale di 250 milligrammi per millilitro e nel tubo RAL o ELV a una concentrazione finale di 500 milligrammi per millilitro. Mescolare la soluzione farmacologica agitando e pipettando fino ad ottenere una soluzione limpida. Sterilizzare le soluzioni utilizzando un filtro a membrana idrofilo PVDF da 0,22 micrometri con una siringa sterile.
Le singole soluzioni farmacologiche possono essere conservate a meno 20 gradi Celsius per 12 settimane. Scongelare appena un'aliquota di ciascuna soluzione farmacologica prima dell'uso a 37 gradi Celsius fino a quando la soluzione diventa limpida. Mescolare bene usando una pipetta.
Combinare i farmaci sciolti in DMSO e mescolare bene per formare un master mix contenente un millilitro di FTC, 1,5 millilitri di TDF e un millilitro di ELV o RAL. Aggiungere 350 microlitri di soluzione master mix cART in una tazza per preparare una tazza di gel dietetico boost cART. Aggiungere 0,75 millilitri di trimetoprim sulfametossasolo nella tazza.
Mescolare accuratamente con punte sterili da un millilitro. Utilizzando una punta di pipetta, aliquote il bicchiere contenente cART su una capsula di Petri da 60 millimetri. Calcola la quantità di cART nella tazza del cibo pesando il cibo per ogni gabbia in base al numero di topi.
Rimuovere il chow normale dalla gabbia e sostituirlo con una tazza di cibo contenente cART. Rinfrescare il cibo cART tre volte a settimana. Pesare le tazze usate per monitorare l'assunzione.
Quindi, pesare i topi settimanalmente per confermare il consumo. Dopo quattro settimane di infezione da HIV-1, i topi sono stati trattati per altre 7,5 settimane, con il regime FTC / TDF / RAL attraverso iniezione sottocutanea o mediante somministrazione orale di FTC / TDF / RAL o FTC / TDF / ELV. Il peso del topo diminuiva continuamente durante l'iniezione sottocutanea giornaliera di cART.
Al contrario, il gel dietetico ha ripristinato il peso del topo ai livelli pre-inizio dell'ART dopo cinque settimane di somministrazione orale di cART. Inoltre, non sono state osservate variazioni significative di peso tra i gruppi RAL o ELV. Entro quattro settimane, il regime alimentare FTC/TDF/ELV e RAL/ART ha soppresso la replicazione virale rispettivamente del 100% e dell'80%.
Il 70% dei topi che hanno ricevuto l'iniezione SC ha raggiunto livelli non rilevabili dopo quattro settimane di trattamento. I risultati hanno confermato che la somministrazione orale ha soppresso la replicazione virale in modo più rapido ed efficiente rispetto alle iniezioni sottocutanee. Inoltre, il regime alimentare cART ha impedito l'ulteriore declino dei rapporti CD4-CD8 nel sangue periferico prima delle iniezioni giornaliere.
È fondamentale mantenere la sterilità di qualsiasi materiale coinvolto nel protocollo durante l'intero processo ed evitare il congelamento e lo scongelamento multipli della soluzione madre cART.
