Наш протокол обеспечивает подробное 2D-картирование времени жизни фосфоресценции и концентрации кислорода в макроскопических объектах, особенно в тканях живых животных и целых животных, с помощью специальных зондов и сенсорных материалов. Эта информация важна для многих областей исследований. В нашем протоколе используется интегрированный и компактный модуль визуализации, который работает в режиме TCSPC и обеспечивает простую и точную визуализацию времени жизни и распределения кислорода в сложных биологических образцах, таких как живая ткань.
Возьмите адаптер Cricket и осмотрите его с разных сторон. Снимите адаптер C-mount на передней стороне, чтобы показать усилитель Photonis PP0360EF, размещенный в Cricket, а затем вставьте адаптер C-mount обратно. Снимите адаптер C-mount C-mount на передней стороне C-mount и вставьте эмиссионный фильтр 650 плюс/минус 50 нанометров.
Исправьте это, вернув C-mount. Затем подключите модуль камеры TPX с тремя кулачками к задней стороне модуля Cricket через их кольцевые адаптеры. Подключите объектив к передней стороне модуля Cricket через адаптер C-mount.
Подключите светодиод к источнику питания и генератору импульсов. Теперь установите 390-нанометровый сверхяркий светодиод на стойку, прикрепленную к макетной плате внутри черного ящика. Включите светодиод и сфокусируйте его, чтобы обеспечить эффективное и равномерное возбуждение изображаемого образца.
Установите камеру в сборе поверх оптического черного ящика лицом вниз к сцене, на которой будут изображены образцы. Подключите камеру и светодиод к двухимпульсным генераторам и четырехканальному осциллографу. С помощью настроек осциллографа и генераторов импульсов синхронизируйте импульсы, посылаемые на камеру, и светодиод.
Используйте специальный кабель и розетку на блоке Cricket, чтобы подключить усилитель к стандартному источнику питания и установить усиление на 2.7 вольта. Расположите образец перед объективом камеры. Затем включите камеру и все электрические модули, кроме усилителя.
Активируйте программное обеспечение SOFI для настройки рабочих параметров, таких как фокусировка и выравнивание образца. В модулях установите выдержку кадра на 0,01 секунды. Выберите «Бесконечные кадры» и установите режим работы пикселей на превышение порогового значения.
Затем перейдите в «Предварительный просмотр» и выберите «Активный модуль», чтобы открыть окно кадров Medipix / Timepix. На следующем шаге, после начала записи, отрегулируйте цветовую шкалу и поверните изображение в нужную ориентацию. После этого выключите свет в комнате и включите усилитель.
Сфокусируйте оптику камеры на предметном столике образца с помощью возможностей фокусировки объектива и адаптера Cricket для создания четких изображений образцов с хорошей контрастностью и яркостью. После завершения фокусировки закройте программное обеспечение SOFI. Затем перейдите в терминал, выполните команды специально разработанного программного обеспечения, чтобы получить необработанные данные в двоичном формате и закрыть терминал.
Откройте новый терминал для обработки полученных данных. Загрузите файл данных и запустите редуктор данных. Проанализируйте данные постобработки с помощью специальной программы, написанной на языке C, которая запишет данные в файл образа ICS.
Затем откройте файлы изображений ICS с помощью свободно доступного программного обеспечения Time Resolution Imaging и используйте две экспоненциальные функции, чтобы соответствовать распадам фосфоресценции. Наконец, откройте Fitted. ICS image с доступным программным обеспечением для анализа изображений.
Создавайте изображения с пожизненным циклом фосфоресценции с помощью таблиц подстановки и кодируйте их в псевдоцветовой шкале. Используйте функцию «Измерение» для расчета средних значений времени жизни для всего изображения или интересующих областей. Показаны изображения интенсивности фосфоресценции и времени жизни фосфоресценции с помощью микроскопии пятна датчика платинового октаэтилпорфиринового красителя в оксигенированном и дезоксигенированном состояниях.
Убедитесь, что внутри Cricket установлен правильный эмиссионный фильтр и используются правильные светодиоды, кабельные соединения и настройки импульсов. В настоящее время этот протокол ограничен животными моделями, но потенциально может применяться для диагностики и лечения патологических состояний, связанных с гипоксией тканей, таких как рак, инсульт и воспаление.
