Unser Protokoll bietet eine detaillierte 2D-Kartierung der Phosphoreszenzlebensdauer und der Sauerstoffkonzentration in makroskopischen Objekten, insbesondere in lebendem tierischem Gewebe und ganzen Tieren, mit Hilfe spezieller Sonden und Sensormaterialien. Diese Informationen sind für viele Forschungsbereiche wichtig. Unser Protokoll verwendet ein integriertes und kompaktes Bildgebungsmodul, das im TCSPC-Modus arbeitet und eine einfache und genaue Visualisierung der Lebensdauer und Sauerstoffverteilung in komplexen biologischen Proben, wie z. B. lebendem Gewebe, ermöglicht.
Nehmen Sie den Cricket-Adapter und inspizieren Sie ihn von verschiedenen Seiten. Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter, um den Photonis PP0360EF-Verstärker im Cricket zu zeigen, und setzen Sie dann den C-Mount-Adapter wieder ein. Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter des Cricket und setzen Sie den 650 plus/minus 50 Nanometer Emissionsfilter ein.
Reparieren Sie es, indem Sie die C-Halterung wieder einsetzen. Verbinden Sie dann das TPX-Kameramodul mit drei Kameras über die Ringadapter mit der Rückseite des Cricket-Moduls. Verbinden Sie das Objektiv über den C-Mount-Adapter mit der Vorderseite des Cricket-Moduls.
Schließen Sie die LED an eine Stromversorgung und einen Impulsgeber an. Montieren Sie nun die superhelle 390-Nanometer-LED an einem Pfosten, der an einem Steckbrett in der Blackbox befestigt ist. Schalten Sie die LED ein und fokussieren Sie sie, um eine effektive und gleichmäßige Anregung der abgebildeten Probe zu gewährleisten.
Montieren Sie die Kamerabaugruppe oben auf der optischen Blackbox mit Blick nach unten in Richtung des Tisches, auf dem die Proben abgebildet werden sollen. Schließen Sie die Kamera und die LED an Zwei-Puls-Generatoren und ein Vierkanal-Oszilloskop an. Synchronisieren Sie mit den Einstellungen des Oszilloskops und der Impulsgeneratoren die an die Kamera gesendeten Impulse und die LED.
Verwenden Sie das spezielle Kabel und die Buchse am Cricket-Gerät, um den Verstärker an ein Standardnetzteil anzuschließen, und stellen Sie die Verstärkung auf 2,7 Volt ein. Positionieren Sie die Probe vor dem Kameraobjektiv. Schalten Sie dann die Kamera und alle elektrischen Module mit Ausnahme des Verstärkers ein.
Aktivieren Sie die SOFI-Software, um die Betriebsparameter wie Fokussierung und Probenausrichtung einzustellen. Stellen Sie in den Modulen die Bildbelichtung auf 0,01 Sekunden ein. Wählen Sie Unendliche Frames und stellen Sie den Pixelbetriebsmodus auf Zeit über Schwellenwert ein.
Gehen Sie dann zur Vorschau und wählen Sie Aktives Modul, um das Medipix/Timepix-Rahmenfenster zu öffnen. Passen Sie im nächsten Schritt nach dem Start der Aufnahme die Farbskala an und drehen Sie das Bild in die gewünschte Ausrichtung. Schalten Sie danach das Licht im Raum aus und schalten Sie den Verstärker ein.
Fokussieren Sie die Kameraoptik mit den Fokussierfunktionen des Objektivs und des Cricket-Adapters auf den Probentisch, um klare Bilder von Proben mit gutem Kontrast und guter Helligkeit zu erzeugen. Sobald der Fokus abgeschlossen ist, schließen Sie die SOFI-Software. Gehen Sie dann zum Terminal, führen Sie die Befehle der benutzerdefinierten Software aus, um die Rohdaten im Binärformat zu erfassen, und schließen Sie das Terminal.
Öffnen Sie ein neues Terminal, um die erfassten Daten zu verarbeiten. Laden Sie die Datendatei und führen Sie den Datenreduzierer aus. Analysieren Sie die Nachbearbeitungsdaten mit einem speziellen Programm, das in der Programmiersprache C geschrieben ist und die Daten in eine ICS-Bilddatei schreibt.
Öffnen Sie anschließend die ICS-Bilddateien mit der frei verfügbaren Software Time Resolved Imaging und verwenden Sie zwei Exponentialfunktionen, um die Phosphoreszenzzerfälle anzupassen. Öffnen Sie zum Schluss die Fitted. ICS-Bilddateien mit der verfügbaren Bildanalyse-Software.
Generieren Sie Bilder mit Phosphoreszenzlebensdauer mithilfe von Lookup-Tabellen und kodieren Sie sie in einer Pseudofarbskala. Verwenden Sie die Funktion Messen, um die durchschnittlichen Lebensdauerwerte für das gesamte Bild oder die relevanten Bereiche zu berechnen. Phosphoreszenzintensität und Phosphoreszenzlebensdauer bildgebende Mikroskopiebilder des Platin-Octaethylporphyrin-Farbstoff-Sensorspots im sauerstoffhaltigen und sauerstoffarmen Zustand werden gezeigt.
Stellen Sie sicher, dass der richtige Emissionsfilter im Cricket montiert ist und die richtige LED, Kabelverbindungen und Impulseinstellungen verwendet werden. Derzeit ist dieses Protokoll auf Tiermodelle beschränkt, kann aber potenziell zur Diagnose und Behandlung pathologischer Zustände im Zusammenhang mit Gewebehypoxie wie Krebs, Schlaganfall und Entzündungen angewendet werden.
