Nosso protocolo fornece mapeamento 2D detalhado da vida útil da fosforescência e da concentração de oxigênio em objetos macroscópicos, particularmente tecidos de animais vivos e animais inteiros, por meio de sondas dedicadas e materiais de detecção. Essas informações são importantes para muitas áreas de pesquisa. Nosso protocolo usa um módulo de imagem integrado e compacto que opera no modo TCSPC e fornece visualização fácil e precisa da vida útil e da distribuição de oxigênio em amostras biológicas complexas, como tecido vital.
Pegue o adaptador de críquete e inspecione-o de diferentes lados. Remova o adaptador de montagem C frontal para mostrar o intensificador de PP0360EF Photonis alojado no Cricket e, em seguida, coloque o adaptador de montagem em C de volta. Remova o adaptador de montagem C frontal do Cricket e insira o filtro de emissão de 650 mais/menos 50 nanômetros.
Corrija-o colocando de volta o C-mount. Em seguida, conecte o módulo de câmera de três cames TPX à parte traseira do módulo Cricket através de seus adaptadores de anel. Conecte a lente à parte frontal do módulo Cricket através do adaptador C-mount.
Conecte o LED a uma fonte de alimentação e a um gerador de pulsos. Agora, monte o LED super brilhante de 390 nanômetros em um poste preso a uma protoboard dentro da caixa preta. Ligue o LED e foque-o para garantir a excitação eficaz e uniforme da amostra que está sendo fotografada.
Monte o conjunto da câmera em cima da caixa preta óptica voltada para baixo em direção ao palco onde as amostras serão fotografadas. Conecte a câmera e o LED a geradores de dois pulsos e a um osciloscópio de quatro canais. Usando configurações no osciloscópio e geradores de pulsos, sincronize os pulsos enviados para a câmera e o LED.
Utilize o cabo e a tomada especiais na unidade Cricket para conectar o intensificador a uma fonte de alimentação padrão e defina o ganho para 2,7 volts. Posicione a amostra antes da lente da câmera. Em seguida, ligue a câmera e todos os módulos elétricos, exceto o intensificador.
Ative o software SOFI para ajustar os parâmetros operacionais, como foco e alinhamento de amostras. Nos módulos, defina a exposição de quadros como 0,01 segundos. Selecione Quadros infinitos e defina o modo de operação de pixel para tempo acima do limite.
Em seguida, vá para Visualizar e selecione Módulo ativo para abrir a janela de quadros Medipix/Timepix. Na etapa seguinte, após iniciar a gravação, ajuste a escala de cores e gire a imagem para a orientação desejada. Depois disso, apague as luzes da sala e ligue o intensificador.
Concentre a óptica da câmera no estágio de amostra com os recursos de foco da lente e do adaptador Cricket para gerar imagens claras de amostras com bom contraste e brilho. Quando o foco estiver concluído, feche o software SOFI. Em seguida, vá para o terminal, execute os comandos do software de design personalizado para adquirir os dados brutos no formato binário e feche o terminal.
Abra um novo terminal para processar os dados adquiridos. Carregue o arquivo de dados e execute o redutor de dados. Analise os dados pós-processo com um programa dedicado escrito em linguagem C que gravará os dados em um arquivo de imagem ICS.
Posteriormente, abra os arquivos de imagem ICS usando o software Time Resolved Imaging disponível gratuitamente e use duas funções exponenciais para ajustar os decaimentos de fosforescência. Por fim, abra o Fitted. Arquivos de imagem ICS com o software de análise de imagem disponível.
Gere imagens de vida útil de fosforescência usando tabelas de pesquisa e codifique-as em pseudoescala de cores. Utilize a função Medir para calcular os valores médios de tempo de vida para toda a imagem ou regiões de interesse. Imagens de microscopia de imagem de intensidade de fosforescência e tempo de vida de fosforescência do ponto sensor do corante octaetilporfirina de platina nos estados oxigenado e desoxigenado são mostradas.
Certifique-se de que o filtro de emissão correto esteja montado dentro do Cricket e que o LED, as conexões de cabo e as configurações de pulso corretos sejam usados. Atualmente, esse protocolo é limitado a modelos animais, mas potencialmente pode ser aplicado para diagnosticar e tratar estados patológicos associados à hipóxia tecidual, como câncer, acidente vascular cerebral e inflamação.
