Этот протокол позволяет расширять и генетически манипулировать функциональными гемопоэтическими стволовыми клетками мыши, что позволяет глубже понять биологию гемопоэтических стволовых клеток и кроветворение. Преимущество этого метода заключается в том, что он может поддерживать гемопоэтические стволовые клетки в длительной культуре ex vivo и позволяет генетическим манипуляциям исследовать генетику кроветворения. Эта культуральная система представляет собой платформенную технологию для различных исследований биологии гемопоэтических стволовых клеток и кроветворения, включая генетические, молекулярные и биохимические исследования.
В таблице устранения неполадок перечислены причины и решения распространенных проблем, возникающих при использовании этого метода. Гораздо проще и эффективнее показать, как правильно извлекать клетки костного мозга и выполнять полную смену среды, чем читать об этом. Чтобы начать экстракцию гемопоэтических стволовых клеток или ГСК, используйте безворсовые деликатные рабочие салфетки для очистки костей, только что выделенных от должным образом усыпленных мышей.
Удалите мышцы и спинной мозг из костей, прежде чем добавлять их в ступку, содержащую примерно три миллилитра PBS. С помощью пестика раздавите кости, не измельчая их, чтобы свести к минимуму усилия сдвига. Затем, используя иглу 19-го калибра, прикрепленную к 5-миллилитровому шприцу, разбейте крупные фрагменты костного мозга, выпущенные в PBS, и перенесите суспензию через 70-микронный фильтр в 50-миллилитровую коническую трубку.
После того, как суспензия будет перенесена, повторите процесс со свежим PBS, пока кости не отбелятся. Стремитесь к конечному объему примерно 30 миллилитров на мышь и 50 миллилитров на двух мышей, чтобы отбелить кости до тех пор, пока костный мозг не станет виден. Подготовьтесь к обогащению колонны, поместив магнитную фильтрационную колонну в магнит магнитного сепаратора с 50-микронным фильтром сверху и конической трубкой объемом 15 миллилитров внизу.
Затем, после обработки клеток аллофикоцианиновым антителом анти-c-Kit и аллофикоцианиновыми магнитными микрошариками, пропустите три миллилитра стерильного PBS через 50-микронный фильтр и фильтрационную колонну. После того, как PBS пройдет, пропустите суспензию ячейки через колонку, а затем каждый раз три промывки по три миллилитра холодного PBS. После каждой стирки подождите, пока колонка перестанет капать, прежде чем добавлять PBS для следующей стирки.
Затем снимите колонку с магнита и поместите ее поверх свежей 15-миллилитровой трубки и добавьте в колонку пять миллилитров холодного PBS, прежде чем установить на нее поршень колонки и элюировать ячейки, нажав на поршень. Следуйте протоколу, описанному в тексте, чтобы подготовить достаточное количество среды HSC для желаемого количества клеток или лунок, чтобы засеять от 0,5 до 1 миллиона клеток на миллилитр. Затем отжимают обогащенные c-Kit гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, или HSPC, и ресуспендируют гранулы в свежеприготовленной среде HSC с желаемой плотностью клеток.
Переносите клетки на пластины, покрытые фибронектином, или на заряженные пластины с отрицательной поверхностью, сохраняя соответствующий объем. Поместите клетки в инкубатор для тканевых культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Аккуратно извлекая пластину из инкубатора для тканевых культур, не нарушая клеточные культуры, используйте пипетку или вакуумный насос для медленной аспирации примерно 90-95% среды из жидкого мениска каждой лунки.
Избегайте вытягивания среды из основания колодца. Затем добавьте в лунку один миллилитр свежей среды, предварительно подогретой до 37 градусов по Цельсию. Верните планшет в инкубатор для тканевых культур и меняйте среду каждые два-три дня, пока этого не потребует эксперимент.
После ресуспендирования клеток в нуклеофекционном буфере немедленно перенесите клеточную суспензию в ПЦР-пробирку, содержащую комплексный рибонуклеопротеин, и осторожно перемешайте, медленно пипетируя вверх и вниз. Теперь очень медленно перелейте смесь в электропорационную кювету соответствующего объема, поддерживая непрерывное движение жидкости, чтобы избежать образования пузырьков воздуха внутри кюветы. Затем на электропораторе выберите положение электропорируемых скважин.
С помощью сенсорного экрана выберите программу типа ячейки как CD34-положительный человек или введите импульсный код EO100, а затем нажмите кнопку OK. Перенесите кювету в электропоратор и нажмите кнопку «Пуск» на сенсорном экране, чтобы начать электропорацию. Сразу после электропорации добавьте в кювету в пять раз больше реакционного объема питательной среды.
Теперь аккуратно перенесите клетки на подготовленную пластину, и поместите пластину обратно в инкубатор для культивирования тканей. После выполнения изменения среды, как показано ранее, соберите 10 микролитров клеток и подсчитайте их с помощью раствора Турка в разведении 1:2 с помощью гемоцитометра. Переложите необходимую дозу клеток в пластины, покрытые фибронектином, для трансдукции и отдельно поместите нетрансдуцированные отрицательные контрольные клетки.
Затем добавьте лентивирусный вектор в каждую лунку, содержащую клетки, поддерживая дозу 20 единиц трансдукции на клетку для достижения эффективности трансдукции около 30%. Однако определяют дозу лентивирусного вектора эмпирически в зависимости от экспериментальных требований. Наконец, верните клетки в инкубатор для тканевых культур на шесть часов.
Выполните изменение среды, как описано ранее. Активированная флуоресценцией сортировка клеток ГСК, обогащенных c-Kit, дала примерно 0,2% клеток, которые были CD150-положительными, CD34-отрицательными, c-Kit-положительными, Sca1-положительными и лайн-отрицательными. После четырех недель культивирования HSPC было обнаружено, что CD201-положительная, CD150-положительная, c-Kit-положительная, Sca1-положительная и линейно-отрицательная фракции составляют около 10%После трансдукции лентивирусным вектором, экспрессирующим GFP, GFP-положительные клетки составляли примерно 30%При слиянии ожидаемая плотность культур составляла около 2 миллионов клеток на миллилитр.
Приблизительно 50% гибели клеток наблюдалось в течение первых 24-48 часов до того, как была выполнена первая смена среды. Однако через неделю количество ячеек вернулось к 80-100% от числа посеянных ячеек. Точная смена сред с использованием свежих и предварительно подогретых сред имеет решающее значение для долгосрочной стабильности этого метода культивирования HSC.
С тех пор, как оригинальный метод был опубликован в 2019 году, область начала использовать его по-разному для изучения биологии ГСК.
