Этот протокол представляет собой справочную информацию о методическом подходе к изучению аутофагов и подробно описывает все экспериментальные процедуры. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет длительно наблюдать за изменением аутофагического потока. Перед началом эксперимента определите эффективную концентрацию инфекции и примите необходимые меры безопасности.
Начните с центрифугирования нейтрализованных клеток миокарда H9C2 при 179G в течение пяти минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и смешайте клетки в полной среде DMEM, осторожно продувая. Разделите ячейки на девять равных пропорций.
Добавьте диметилсульфоксид в контрольную группу. Затем добавьте различные концентрации кроцетина к остальным группам. Засейте 100 микролитров клеток в лунку в 96-луночную тарелку.
После инкубации в течение 24 часов выбросьте надосадочную жидкость. Затем трижды промойте клетки с помощью PBS. Добавьте 100 микролитров базальной среды DMEM в каждую лунку и инкубируйте клетки в течение четырех часов при температуре 37 градусов Цельсия.
Теперь добавьте 20 микролитров MTS и инкубируйте еще два часа, как показано на рисунке. Наконец, измерьте поглощение на 490 нанометрах и рассчитайте жизнеспособность клеток. Чтобы определить АФК, разбавьте DCFH-DA в соотношении 1:1000 средой, не содержащей сыворотки.
Выбросьте надосадочную жидкость клетки из 48-луночной пластины, ранее засеянной клетками H9C2. Затем дважды промойте клетки средством, не содержащим сыворотки. Добавьте 150 микролитров разбавленного DCFH-DA в каждую лунку и выдерживайте при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут.
Далее трижды промойте клетки средством, не содержащим сыворотки. Наконец, сделайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа. Чтобы проанализировать мембранный потенциал митохондрий, добавьте рабочий раствор JC-1 к ранее культивируемым клеткам и хорошо перемешайте.
Инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем дважды промойте клетки буфером для окрашивания JC-1. Добавьте полную среду в каждую лунку и сделайте фотографии с помощью флуоресцентного микроскопа.
Зафиксируйте клетки раствором для фиксации клеток на 30 минут при комнатной температуре. Затем промойте их PBS один раз. Добавьте 0,3% Тритона-100 в каждую лунку и выдержите при комнатной температуре в течение пяти минут.
После двух промывок PBS добавьте рабочий раствор TUNEL в каждую лунку и инкубируйте ячейки при температуре 37 градусов Цельсия в темноте в течение 60 минут. Добавьте DAPI, содержащий антифлуоресцентную таблетку, и сделайте снимки, как показано на рисунке. Замените половину среды из ранее культивируемых клеток свежей средой в каждой лунке 48-луночной пластины.
Добавьте аденовирус mCherry GFP-LC3B, а затем полибрен, чтобы повысить эффективность инфекции. Меняйте носитель каждые 24 часа. Одновременно с помощью конфокального микроскопа наблюдайте экспрессию флуоресцентного белка для подтверждения инфекции.
После заражения культивируйте и захватывайте клетки, как описано в рукописи. Начните с фиксации ранее культивируемых клеток 4% параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре и добавьте 0,1% Тритона-100. Затем заблокируйте клетки блочным раствором, не содержащим животных, в течение одного часа.
Затем инкубируйте их с первичным антителом при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день добавьте флуоресцентное вторичное антитело в клетки и инкубируйте их в темноте в течение одного часа. Наконец, перед захватом изображений добавьте DAPI, содержащие таблетки для гашения флуоресценции.
В настоящем исследовании кроцетин оказывал значительное пролиферативное действие на клетки. В то время как концентрация выше 200 мкмоль ингибировала пролиферацию клеток H9C2. Жизнеспособность клеток значительно снижалась после обработки перекисью водорода.
Однако кроцетин в определенной степени обратил вспять это изменение. Повышенный уровень АФК после обработки перекисью водорода был в некоторой степени обращен вспять кроцетином. Результаты флуоресценции также подтвердили снижение АФК с кроцетином.
Кроме того, кроцетин дополнительно восстанавливал коллапс потенциала митохондриальной мембраны, вызванный обработкой перекисью водорода. Точно так же апоптоз также был обращен вспять кроцетином. Кроме того, предварительная обработка кроцетином обратила вспять аутофагический поток кардиомиоцитов H9C2, индуцированный из-за лечения перекисью водорода.
Предварительная обработка кроцетином также уменьшала транслокацию митохондрий Паркина, вызванную обработкой перекисью водорода. Следуя этой процедуре, электронная микроскопия также может быть использована для непосредственного наблюдения за микрофагом, что позволяет получить более интуитивное представление о митохондриях, поглощенных аутофагосомами.
