Среди методов иммунологического анализа, направленных на диагностику заболеваний, цитометрический анализ шариков стал высокочувствительным и надежным подходом, анализирующим тысячи частиц в одном анализе. Высокая точность проточной цитометрии в сочетании с низкой стоимостью латексных шариков делают нашу методику применимой для анализа инструментов иммунологического анализа, таких как антитела и антигены. Антитела IgY имеют низкую стоимость и этические преимущества в их производстве, и могут использоваться в качестве инструмента обнаружения редких заболеваний.
Начните с погружения свежеотложенных или четырехдневных яиц из белой линии Gallus gallus deckle в раствор гипохлорита натрия, разбавленный 0,2%. Быстро промойте их под проточной водой и аккуратно протрите. Яйцо аккуратно разбить, отделить желток от белка с помощью желткового сепаратора.
И удалите излишки белила фильтровальной бумагой. Проткните желток, и соберите его внутреннюю часть в коническую трубочку объемом 50 миллилитров. Храните желток при температуре минус 20 градусов Цельсия не менее 24 часов перед использованием.
После размораживания хранящегося желтка разведите его в соотношении один к 10 в одном миллимолярном PBS. Отрегулируйте рН раствора до пяти, с помощью одной обычной соляной кислоты, и инкубируйте раствор при четырех градусах Цельсия в течение шести-24 часов. Центрифугируют раствор при 3000 G в течение 40 минут и фильтруют восстановленную надосадочную жидкость с помощью целлюлозного фильтра 0,7 мм, прежде чем отрегулировать pH надосадочной жидкости до пяти.
Добавьте каприловую кислоту до конечной концентрации 8,7% при постоянном помешивании в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После центрифугирования образцов в течение 15 минут отделяют надосадочную жидкость от осажденного материала. Доведите рН раствора до 7,4 с помощью одного молярного гидроксида натрия.
И количественно оценить антитела с помощью анализа Брэдфорда, прежде чем хранить их при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Добавьте 21 микролитр EDC и 21 микролитр NHS к 21 микролитру латексных шариков. И довести до конечного объема 2,1 миллилитра с отфильтрованным 10 миллимолярным PBS.
Выдерживают раствор при температуре 22 градуса Цельсия, при быстром встряхивании, в течение трех часов. Добавьте ранее экстрагированное антитело захвата, IgY PfHRP2, в различные микропробирки, содержащие 100 микролитров этого раствора. И снова выдерживают в течение 16 часов.
После центрифугирования образцов и удаления надосадочной жидкости дважды промыть латексные шарики 500 микролитрами фильтрованного 10-миллимолярного PBS, используя циклы центрифугирования и ресуспендирования. Для блокировки гранул повторно суспендируйте образцы в одном миллилитре блокирующего буфера и выполните ту же процедуру, что и ранее, чтобы инкубировать его в течение двух часов. После промывки шариков PBS снова ресуспендируйте их в 10-миллимолярном буфере PBS.
Добавьте в каждую микропробирку 100 микролитров флуоресцентных антикуриных антител, разбавленных до 1 к 2000 в 10-миллимолярной смеси PBS и BSA. Инкубируют образцы в темноте в течение 30 минут. После промывки шариков снова суспендируйте их 250 микролитрами фильтрованного 10 миллимолярного PBS.
Определите предел обнаружения, распределив 100 микролитров препарата из блокированного шарика в пробирки, содержащие различное количество разбавленного рекомбинантного белка PfHRP2 в трех экземплярах. Инкубируйте растворы гранул с белком при температуре 22 градуса Цельсия при быстром встряхивании в течение одного часа. Промойте шарики 500 микролитрами фильтрованного 10 миллимолярного PBS с центрифугированием, как было показано ранее.
После выброса надосадочной жидкости добавьте два микрограмма мышиного антитела IgG против рекомбинантного белка, разведенного в 10 миллимолярных PBS и BSA, к каждому образцу и выполните ту же процедуру для инкубации. Затем добавьте в каждый образец 100 микролитров разбавленного флуоресцентного антитела против мышей. После инкубации повторно суспендируют образец в 250 микролитрах отфильтрованного 10 миллимолярного PBS.
Включите компьютер и проточный цитометр и подождите несколько минут, пока оборудование подключится к компьютеру. Нажмите на программное обеспечение для цитометрии, установленное на компьютере, и войдите в него. В рабочей области программного обеспечения выберите «Цитометр», затем «Запуск жидкости», «Режимы очистки» и «Промывка SIT».
Определите стратегию стробирования на основе морфометрических и флуоресцентных характеристик отрицательной управляющей частицы. Чтобы определить морфометрию клеток, выберите график точечной диаграммы для анализа параметров прямого рассеяния A с использованием бокового рассеяния A. Определите одиночные ячейки по боковому рассеянию с помощью графика точечного графика для анализа бокового рассеяния W по оси Y и бокового рассеяния H по оси X. И определите одиночные ячейки по прямому рассеянию, используя график точечного графика, для анализа прямого рассеяния W по оси Y и прямого рассеяния H по оси X.
Для флуоресцентного анализа выберите точечные графики FL1 с использованием прямого рассеяния A. Используйте пробирку из полистирола с пробкой, содержащую немаркированные образцы, и образцы, ранее помеченные одноцветным Alexa Fluor 488, и тщательно перемешайте содержимое пробирки. Прикрепите пробирку к зонду проточного цитометра и щелкните левой кнопкой мыши на Acquire. Чтобы установить мощность лазеров, нажмите на «Параметры», а в опциях ниже отрегулируйте напряжение прямого рассеяния на 182 вольта, а напряжение бокового рассеяния на 236 вольт.
Чтобы установить пороговое значение на цитометре, нажмите «Порог» и в опциях ниже установите FSC на 500 вольт. Установите вентиль анализа для определения характеристик частиц по размеру и сложности, а также для выполнения анализа отдельных ячеек. Удалите автофлуоресценцию, проанализировав образец без красителя, содержащий только латексные шарики, и отрегулировав напряжение детектора FL1 FITC до 332 вольт.
Задайте вентиль флуоресцентного анализа в четырехугольном формате от отрицательной точки, показанной на точечном графике. После настройки морфометрического и флуоресцентного анализов настройте устройство на 50 000 событий и нажмите «Запись». Здесь показаны электрофоретические профили антитела IgY PfHRP2, обусловленные разделением с помощью каприловой кислоты.
Из этого рисунка видно, что антитела до и после разделения каприловой кислоты показали схожие электрофоретические профили с характерными полосами 65 килодальтон и 27 килодальтон, которые относятся к легким и тяжелым цепям IgY. В дополнение к ним также видны другие полосы, вероятно, из-за предшественника С-концевого фрагмента белка яичного желтка вителлогенина II. Оценка концентрации сатурации антител на латексных шариках имеет жизненно важное значение для разработки иммуноферментного анализа с шариками.
Здесь показана кривая процентной флуоресценции различных концентраций антител в сочетании с каждым микролитром используемых коммерческих латексных шариков. По мере увеличения концентрации процентные значения также увеличивались и выходили на плато на уровне двух микрограммов концентрации антител, что делало ее оптимальной концентрацией связывания для иммуноферментного анализа на целевой антиген. Предел обнаружения определяли путем оценки процента флуоресценции скоростной реактивности латекса на фоне различных концентраций белка rPfHRP2.
Из сэндвич-иммуноанализа было замечено, что флуоресценция увеличивалась с 0,01 мкг белка PfHRP2 и выходила на плато на уровне 0,1 мкг. Не было существенной разницы во флуоресценции при 0 микрограммах и 0,01 мкг. Однако существенная разница в флуоресценции наблюдалась при 0,01 мкг, 0,1 мкг и 10 мкг.
Этап промывки этого протокола имеет решающее значение для предотвращения потери шариков. Датчик должен быть четко определен, чтобы не было ошибок в полученном результате. Описанные здесь этапы представляют собой важную стандартизацию, которая необходима для обеспечения надежности диагностических тестов с использованием латексных шариков, которые оцениваются с помощью полной цитометрии.
Поэтому данная методика является альтернативой классическим моделям сэндвич-тестов. Этот метод может быть применен к различным типам анализов и может быть пригоден для совладания нескольких молекул с поверхностью шариков, а также для обнаружения различных аналитов.
