У бактерий изучение динамики белков клеточного деления требует пространственной ориентации клеток. Например, в случае Z-кольца, основного компонента в делении бактериальных клеток, вертикальная ориентация имеет основополагающее значение для записи всей структуры в плоскости XY. В этом видео мы разрабатываем метод достижения этой конкретной ориентации в нитчатых цианобактериях Anabaena.
Анабаена является многоклеточным фотосинтезирующим организмом и разделяет с другими бактериями способность использовать атмосферный динитроген в качестве источника азота. В отсутствие этого элемента Anabaena дифференцируют клетки, специализирующиеся на фиксации азота. Таким образом, он предоставляет отличную модель для анализа взаимосвязи между клеточным делением и многоклеточностью.
Во-первых, выберите компонент дивисомы, присутствующий в целевом нитчатом штамме цианобактерий. Для эксперимента необходимо сконструировать нитчатый мутант цианобактерий, экспрессирующий выбранный компонент дивисомы, слитый с флуоресцентным белком. В этом протоколе мы используем мутант Anabaena, который экспрессирует FtsZ, слитый с GFP, в качестве примера.
Сначала сделайте свежую субкультуру мутанта с 10 миллилитрами культуры в стационарной фазе и 90 миллилитрами жидкой среды. Затем выращивают новую клеточную культуру при постоянном освещении и при оптимальной температуре, пока не достигнут экспоненциальной фазы. В нашем примере мутанта выращивали при температуре 25 градусов по Цельсию в течение семи дней.
Теперь возьмите два миллилитра ростовой культуры и поместите ее в центрифужную пробирку. Центрифуга при 2 500 х г в течение 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования убедитесь, что все ячейки находятся на дне пробирки.
Будьте осторожны при обращении с образцами, чтобы избежать повторного взвешивания. Нагрейте 3%-ный раствор агарозы с низкой температурой плавления в микроволновой печи. Важно делать это через короткие промежутки времени, и проверять раствор до полной жидкости.
Как только он растает, отложите в сторону, чтобы остыть. Возьмите центрифужные пробирки предыдущего этапа, выбросьте 1,9 миллилитра надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки в оставшемся объеме, пипеткой не менее трех раз вверх и вниз. На рабочее место положите пробирку с клетками, расплавленный раствор агарозы, одномиллилитровый шприц, вырезанный в наконечнике, и скальпель с новым чистым лезвием.
Затем смешайте клетки с 900 микролитрами 3%-ного раствора агарозы путем пипетки не менее трех раз. Очень важно следить, чтобы раствор агарозы не был слишком горячим, а оставался жидким. Таким образом, мы избегаем повреждения клеток во время этого процесса.
Следующий шаг нужно сделать быстро, и до того, как раствор агарозы загустеет. Осторожно рассосите агарозную матрицу в одномиллилитровом шприце. Важно избегать образования пузырьков во время всасывания образца.
После этого инкубируют образец, поставив шприц в горизонтальное положение при комнатной температуре на два часа. После инкубации аккуратно удалите матрицу с клетками с помощью поршня на чистой и ровной поверхности. С помощью скальпеля нарежьте образец геля на дольки как можно тоньше, сохраняя целостность матрицы.
Затем поместите образцы в соответствующее покровное стекло рядом. Как показано на видео, на этом шаге вы можете использовать подсказку, чтобы помочь в процессе обработки образца. Для покадровых экспериментов рекомендуется использовать клеточную камеру, предназначенную для микроскопического анализа.
В этом случае мы используем круглые покровные стекла, которые подходят для камер такого типа, как вы можете видеть на видео. Наконец, чтобы предотвратить обезвоживание образца, добавьте дополнительный объем расплавленного 3%-ного раствора агарозы внутрь камеры. Перед визуализацией дождитесь полного гелеобразования агарозы.
Теперь поместите камеру с клетками в микроскоп для визуализации. Рекомендуется использовать оборудование с контролем температуры и влажности. Визуализируйте образец в ярком поле с максимальным увеличением и выполните поиск вертикально ориентированной нити.
Найти интересующий участок деления можно при первичном сканировании с использованием сигнала автофлуоресценции вдоль плоскости Z. При этом используйте параметры вашего флуоресцентного белкового маркера, чтобы визуализировать сигнал интересующего вас белка в месте деления. Теперь вы можете проводить покадровые эксперименты в соответствии с биологической моделью и интересующим белком.
В этом случае мы можем увидеть всю структуру Z-кольца у мутанта FtsZ-GFP, в плоскости XY. С помощью нашего метода мы смогли зафиксировать динамику этих колец за длительный промежуток времени. Наконец, с изменениями интенсивности флуоресценции мы приходим к выводу, что эта структура очень динамична в нашей модели.
Этот метод представляет собой быстрый и недорогой протокол для регистрации динамики белка в месте деления с помощью конфокальной микроскопии, применяемой к сложным морфологиям в виде нитевидных цианобактерий с использованием Anabaena в качестве модели.
