En las bacterias, el estudio de la dinámica de las proteínas de división celular requiere una orientación espacial de las células. Por ejemplo, en el caso del anillo Z, el componente principal en la división celular bacteriana, una orientación vertical es fundamental para registrar toda la estructura en el plano XY. En este video, desarrollamos un método para lograr esta orientación particular en la cianobacteria filamentosa Anabaena.
Anabaena es un organismo fotosintético multicelular, y comparte con otras bacterias la capacidad de utilizar el dinitrógeno atmosférico como fuente de nitrógeno. En ausencia de este elemento, Anabaena diferencia las células especializadas en la fijación de nitrógeno. Por lo tanto, proporciona un excelente modelo en el que analizar la relación entre la división celular y la multicelularidad.
Primero, seleccione un componente divisoma presente en la cepa de cianobacterias filamentosas objetivo. Para el experimento, es necesario construir un mutante cianobacteriano filamentoso que exprese el componente divisoma seleccionado fusionado a una proteína fluorescente. En este protocolo, usamos un mutante Anabaena que expresa FtsZ fusionado a GFP como ejemplo.
Primero, haga un nuevo subcultivo del mutante con 10 mililitros de un cultivo en fase estacionaria y 90 mililitros de medio líquido. Luego crece el nuevo cultivo celular en luz constante y a la temperatura óptima, hasta alcanzar la fase exponencial. En nuestro ejemplo, el mutante se cultivó a 25 grados centígrados durante siete días.
Ahora tome dos mililitros del cultivo de crecimiento y póngalo en un tubo de centrífuga. Centrifugar a 2, 500 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, verifique que todas las celdas estén en el fondo del tubo.
Tenga cuidado al manipular las muestras, para evitar la resuspensión. Caliente la solución de agarosa de bajo punto de fusión al 3% en un microondas. Es importante hacer esto en intervalos de tiempo cortos y verificar la solución hasta que esté completamente líquida.
Una vez que se derrita, deje a un lado para que se enfríe. Tome los tubos de centrífuga del paso anterior, deseche 1,9 mililitros del sobrenadante y vuelva a suspender las celdas en el volumen restante pipeteando al menos tres veces hacia arriba y hacia abajo. En su lugar de trabajo, coloque el tubo con las células, la solución de agarosa derretida, una jeringa de un mililitro cortada en la punta y un bisturí con una cuchilla nueva y limpia.
Luego mezcle las células con 900 microlitros de la solución de agarosa al 3% pipeteando al menos tres veces. Es realmente importante asegurarse de que la solución de agarosa no esté demasiado caliente, sino que permanezca líquida. Con esto, estamos evitando el daño celular durante este proceso.
El siguiente paso debe hacerse rápidamente, y antes de que la solución de agarosa se gelifique. Chupe la matriz de agarosa en una jeringa de un mililitro, con cuidado. Es importante evitar la generación de burbujas mientras se aspira la muestra.
Después de eso, incubar la muestra, poniendo la jeringa en posición horizontal a temperatura ambiente durante dos horas. Después de la incubación, retire cuidadosamente la matriz con las células usando el émbolo en una superficie limpia y plana. Usando el bisturí, corte la muestra de gel en rodajas lo más delgadas posible, manteniendo la integridad de la matriz.
A continuación, deposite las muestras en el cubreobjetos correspondiente, una al lado de la otra. Como se muestra en el video, en este paso, puede usar una sugerencia para ayudar en el proceso de manejo de la muestra. Para experimentos de lapso de tiempo, se recomienda el uso de una cámara celular hecha para el análisis de microscopía.
En este caso, utilizamos cubreobjetos circulares que encajan en este tipo de cámaras, como podéis ver en el vídeo. Finalmente, para evitar la deshidratación de la muestra, agregue un volumen adicional de solución de agarosa derretida al 3% dentro de la cámara. Antes de las imágenes, espere hasta que la agarosa esté completamente gelificada.
Ahora coloque la cámara con las células en el microscopio para obtener imágenes. Es recomendable utilizar un equipo con control de temperatura y humedad. Visualice la muestra en campo brillante con el máximo aumento y busque un filamento orientado verticalmente.
Puede encontrar el sitio de división de interés con un escaneo inicial utilizando la señal de autofluorescencia a lo largo del plano Z. Con esto, use los parámetros de su marcador de proteína fluorescente para visualizar la señal de su proteína de interés en el sitio de división. Ahora puede realizar experimentos de lapso de tiempo de acuerdo con el modelo biológico y la proteína de interés.
En este caso, podemos ver toda la estructura del anillo Z en el mutante FtsZ-GFP, en el plano XY. Con nuestro método, fuimos capaces de registrar la dinámica de estos anillos en un largo período de tiempo. Finalmente, con los cambios en la intensidad de fluorescencia, concluimos que esta estructura es altamente dinámica en nuestro modelo.
Este método es un protocolo rápido y económico para registrar la dinámica de proteínas en el sitio de división mediante microscopía confocal aplicada a morfologías complejas como cianobacterias filamentosas, utilizando Anabaena como modelo.
