細菌では、細胞分裂タンパク質の動態の研究は細胞の空間的配向を必要とする。例えば、細菌の細胞分裂における主成分であるZリングの場合、全体の構造をXY平面に記録するには垂直配向が基本となる。このビデオでは、糸状シアノバクテリアアナバエナでこの特定の配向を達成する方法を開発します。
アナバエナは多細胞光合成生物であり、他の細菌と大気中の二窒素を窒素源として使用する能力を共有しています。この要素がない場合、アナバエナは窒素固定に特化した細胞を分化させます。したがって、細胞分裂と多細胞性との関係を解析するための優れたモデルを提供する。
まず、対象糸状シアノバクテリア株に存在する二種成分を選択する。実験のためには、蛍光タンパク質に融合した選択されたディビソーム成分を発現する糸状シアノバクテリア変異体を構築する必要がある。このプロトコルでは、GFPに融合したFtsZを発現するアナバエナ変異体を例として使用します。
まず、固定期の培養液10ミリリットルと液体培地90ミリリットルで変異体の新鮮な継代培養を行います。次に、指数関数的段階に達するまで、一定の光と最適な温度で新しい細胞培養を増殖させます。この例では、変異体は摂氏25度で7日間成長しました。
今度は成長文化の2ミリリットルを取り、それを遠沈管に入れます。室温で10分間、2, 500 x gで遠心分離します。遠心分離後、すべての細胞がチューブの底にあることを確認します。
サンプルの取り扱い中は、再懸濁を避けるために注意してください。3%低融点アガロース溶液を電子レンジで加熱します。これを短時間で行い、完全に液体になるまで溶液を確認することが重要です。
溶けたら、冷やすために取っておきます。前のステップの遠沈管を取り、1.9ミリリットルの上清を捨て、少なくとも3回上下にピペッティングすることによって残りの容量の細胞を再懸濁する。あなたの職場に、細胞の入ったチューブ、溶けたアガロース溶液、先端を切った1ミリリットルの注射器、そして新しくてきれいな刃のメスを入れてください。
次に、少なくとも3回ピペッティングすることにより、細胞を900マイクロリットルの3%アガロース溶液と混合します。アガロース溶液が熱すぎず、液体のままであることを確認することは本当に重要です。これにより、このプロセス中の細胞の損傷を回避できます。
次のステップは、アガロース溶液がゲル化する前に迅速に行う必要があります。アガロースマトリックスを1ミリリットルの注射器で慎重に吸い上げます。サンプルが吸い上げられている間、気泡の発生を避けることが重要です。
その後、サンプルをインキュベートし、シリンジを室温で2時間水平位置に置きます。インキュベーション後、清潔で平らな面でプランジャーを使用して細胞と一緒にマトリックスを慎重に取り除きます。メスを使用して、マトリックスの完全性を維持しながら、ゲルサンプルをできるだけ薄くスライスします。
次に、サンプルを対応するカバーガラスに並べて堆積させます。ビデオに示されているように、このステップでは、サンプルの取り扱いプロセスを支援するためにチップを使用できます。タイムラプス実験には、顕微鏡分析用に作られたセルチャンバーの使用をお勧めします。
この場合、ビデオでわかるように、これらのタイプのチャンバーに収まる円形のカバースリップを使用します。最後に、サンプルの脱水を防ぐために、チャンバー内に溶融した3%アガロース溶液を追加量追加します。イメージングする前に、アガロースが完全にゲル化するまで待ちます。
次に、細胞の入ったチャンバーを顕微鏡に入れてイメージングします。温度と湿度が制御された機器を使用することをお勧めします。最大倍率で明視野でサンプルを視覚化し、垂直方向のフィラメントを検索します。
Z平面に沿った自家蛍光シグナルを使用した初期スキャンで、目的の分割部位を見つけることができます。これにより、蛍光タンパク質マーカーのパラメーターを使用して、分裂部位で目的のタンパク質のシグナルを視覚化します。これで、生物学的モデルと目的のタンパク質に従ってタイムラプス実験を実行できます。
この場合、FtsZ-GFP変異体のZリングの全体構造をXY平面で見ることができます。私たちの方法では、これらのリングのダイナミクスを長期間にわたって記録することができました。最後に、蛍光強度の変化により、この構造はモデルで非常に動的であると結論付けます。
この方法は、アナバエナをモデルとして、糸状シアノバクテリアとして複雑な形態に適用される共焦点顕微鏡によって、分裂部位のタンパク質動態を登録するための迅速かつ安価なプロトコルです。
