Bakterilerde, hücre bölünmesi proteinlerinin dinamiklerinin incelenmesi, hücrelerin uzamsal bir yönelimini gerektirir. Örneğin, bakteriyel hücre bölünmesindeki ana bileşen olan Z-halkası durumunda, tüm yapıyı XY düzleminde kaydetmek için dikey bir yönelim esastır. Bu videoda, filamentli siyanobakteriler Anabaena'da bu özel oryantasyonu elde etmek için bir yöntem geliştiriyoruz.
Anabaena, çok hücreli fotosentetik bir organizmadır ve atmosferik diazotu azot kaynağı olarak kullanma yeteneğini diğer bakterilerle paylaşır. Bu elementin yokluğunda, Anabaena azot fiksasyonunda uzmanlaşmış hücreleri farklılaştırır. Bu nedenle, hücresel bölünme ve çok hücrelilik arasındaki ilişkiyi analiz etmek için mükemmel bir model sağlar.
İlk olarak, hedef filamentli siyanobakteriyel suşta bulunan bir bölücü bileşen seçin. Deney için, bir floresan proteinine kaynaşmış seçilmiş bölücü bileşeni ifade eden filamentli bir siyanobakteriyel mutant oluşturmak gerekir. Bu protokolde, örnek olarak GFP ile kaynaşmış FtsZ'yi ifade eden bir Anabaena mutantı kullanıyoruz.
İlk olarak, sabit fazda 10 mililitre bir kültür ve 90 mililitre sıvı ortam ile mutantın taze bir alt kültürünü yapın. Daha sonra yeni hücre kültürünü üstel faza ulaşana kadar sabit ışıkta ve optimum sıcaklıkta büyütün. Örneğimizde, mutant yedi gün boyunca 25 santigrat derecede yetiştirildi.
Şimdi büyüme kültürünün iki mililitresini alın ve bir santrifüj tüpüne koyun. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2.500 x g'de santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, tüm hücrelerin tüpün dibinde olup olmadığını kontrol edin.
Yeniden askıya alınmayı önlemek için numuneleri kullanırken dikkatli olun. % 3 düşük erime noktalı agaroz çözeltisini bir mikrodalgada ısıtın. Bunu kısa zaman aralıklarında yapmak ve çözeltiyi tamamen sıvı olana kadar kontrol etmek önemlidir.
Eritildikten sonra soğuması için bir kenara koyun. Önceki adımın santrifüj tüplerini alın, süpernatanın 1,9 mililitresini atın ve kalan hacimdeki hücreleri en az üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. İş yerinize, tüpü hücrelere, erimiş agaroz çözeltisine, ucunda kesilmiş bir mililitrelik bir şırıngaya ve yeni ve temiz bir bıçağa sahip bir neşter koyun.
Daha sonra hücreleri en az üç kez pipetleyerek 900 mikrolitre% 3 agaroz çözeltisi ile karıştırın. Agaroz çözeltisinin çok sıcak olmadığından, ancak sıvı kaldığından emin olmak gerçekten önemlidir. Bununla, bu işlem sırasında hücre hasarını önlüyoruz.
Bir sonraki adım hızlı bir şekilde ve agaroz çözeltisi jelleşmeden önce yapılmalıdır. Agaroz matrisini bir mililitrelik bir şırıngada dikkatlice emin. Numune emilirken kabarcıkların oluşmasını önlemek önemlidir.
Bundan sonra, şırıngayı iki saat boyunca oda sıcaklığında yatay konuma getirerek numuneyi inkübe edin. İnkübasyondan sonra, pistonu temiz ve düz bir yüzeyde kullanarak matrisi hücrelerle dikkatlice çıkarın. Neşteri kullanarak, jel numunesini matrisin bütünlüğünü koruyarak mümkün olduğunca ince dilimler halinde kesin.
Daha sonra numuneleri ilgili kapak fişine yan yana koyun. Videoda gösterildiği gibi, bu adımda, numunenin işleme sürecine yardımcı olması için bir ipucu kullanabilirsiniz. Hızlandırılmış deneyler için, mikroskopi analizi için yapılmış bir hücre odasının kullanılması önerilir.
Bu durumda, videoda görebileceğiniz gibi, bu tür odalara uyan dairesel kapak fişleri kullanıyoruz. Son olarak, numunenin dehidrasyonunu önlemek için, odanın içine fazladan bir hacimde% 3 erimiş agaroz çözeltisi ekleyin. Görüntülemeden önce, agaroz tamamen jelleşene kadar bekleyin.
Şimdi odayı görüntüleme için mikroskoptaki hücrelerle birlikte koyun. Sıcaklık ve nem kontrolü olan bir ekipman kullanılması tavsiye edilir. Numuneyi parlak alanda maksimum büyütme ile görselleştirin ve dikey olarak yönlendirilmiş bir filament arayın.
İlgilendiğiniz bölme bölgesini, Z düzlemi boyunca otofloresan sinyalini kullanarak ilk taramayla bulabilirsiniz. Bununla, bölünme bölgesinde ilgilendiğiniz proteinin sinyalini görselleştirmek için floresan protein işaretleyicinizin parametrelerini kullanın. Artık biyolojik modele ve ilgilendiğiniz proteine göre hızlandırılmış deneyler yapabilirsiniz.
Bu durumda, Z-halkasının tüm yapısını FtsZ-GFP mutantında, XY düzleminde görebiliriz. Yöntemimiz ile bu halkaların dinamiklerini uzun sürede kayıt altına alabildik. Son olarak, floresan yoğunluğundaki değişikliklerle, bu yapının modelimizde oldukça dinamik olduğu sonucuna varıyoruz.
Bu yöntem, Anabaena'yı model olarak kullanarak, filamentli siyanobakteriler olarak karmaşık morfolojilere uygulanan konfokal mikroskopi ile bölünme bölgesindeki protein dinamiklerini kaydetmek için hızlı ve ucuz bir protokoldür.
