Em bactérias, o estudo da dinâmica de proteínas de divisão celular requer uma orientação espacial das células. Por exemplo, no caso do anel Z, o principal componente na divisão celular bacteriana, uma orientação vertical é fundamental para registrar toda a estrutura no plano XY. Neste vídeo, desenvolvemos um método para alcançar essa orientação particular na cianobactéria filamentosa Anabaena.
Anabaena é um organismo fotossintético multicelular, e compartilhar com outras bactérias a capacidade de usar dinitrogênio atmosférico como fonte de nitrogênio. Na ausência deste elemento, Anabaena diferenciar células especializadas na fixação de nitrogênio. Portanto, fornece um excelente modelo para analisar a relação entre divisão celular e multicelularidade.
Primeiro, selecione um componente divisômico presente na cepa de cianobactéria filamentosa alvo. Para o experimento, é necessário construir um mutante cianobacteriano filamentoso que expresse o componente divisômico selecionado fundido a uma proteína fluorescente. Neste protocolo, usamos um mutante Anabaena que expressa FtsZ fundido à GFP como exemplo.
Primeiro, faça uma nova subcultura do mutante com 10 mililitros de uma cultura em fase estacionária e 90 mililitros de meio líquido. Em seguida, cultivar a nova cultura celular em luz constante e na temperatura ideal, até atingir a fase exponencial. Em nosso exemplo, o mutante foi cultivado a 25 graus Celsius por sete dias.
Agora pegue dois mililitros da cultura de crescimento e coloque-a em um tubo de centrífuga. Centrifugar a 2, 500 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após a centrifugação, verifique se todas as células estão no fundo do tubo.
Tenha cuidado ao manusear as amostras, para evitar a ressuspensão. Aqueça a solução de agarose de baixo ponto de fusão a 3% no micro-ondas. É importante fazer isso em curtos intervalos de tempo, e verificar a solução até ficar completamente líquida.
Depois de derretido, reserve para esfriar. Pegue os tubos de centrífuga da etapa anterior, descarte 1,9 mililitros do sobrenadante e ressuspenda as células no volume restante pipetando pelo menos três vezes para cima e para baixo. No seu local de trabalho, coloque o tubo com as células, a solução de agarose derretida, uma seringa de um mililitro cortada na ponta e um bisturi com uma lâmina nova e limpa.
Em seguida, misturar as células com 900 microlitros da solução de agarose a 3%, pipetando pelo menos três vezes. É realmente importante certificar-se de que a solução de agarose não é muito quente, mas permanece líquida. Com isso, estamos evitando danos celulares durante esse processo.
O próximo passo deve ser feito rapidamente, e antes que a solução de agarose gelifique. Sugue a matriz de agarose em uma seringa de um mililitro, cuidadosamente. É importante evitar a geração de bolhas enquanto a amostra está sendo sugada.
Em seguida, incubar a amostra, colocando a seringa na posição horizontal à temperatura ambiente por duas horas. Após a incubação, remova cuidadosamente a matriz com as células usando o êmbolo em uma superfície limpa e plana. Com o bisturi, corte a amostra de gel em fatias o mais finas possível, mantendo a integridade da matriz.
Em seguida, deposite as amostras na tampa correspondente, lado a lado. Como mostrado no vídeo, nesta etapa, você pode usar uma dica para auxiliar no processo de manuseio da amostra. Para experimentos de lapso de tempo, recomenda-se o uso de uma câmara celular feita para análise de microscopia.
Neste caso, utilizamos tampas circulares que se encaixam neste tipo de câmaras, como pode ver no vídeo. Finalmente, para evitar a desidratação da amostra, adicione um volume extra de solução de agarose 3% derretida dentro da câmara. Antes de fazer exames de imagem, aguarde até que a agarose esteja completamente gelificada.
Agora coloque a câmara com as células no microscópio para geração de imagens. É recomendável utilizar um equipamento com controle de temperatura e umidade. Visualize a amostra em campo brilhante com ampliação máxima e procure um filamento orientado verticalmente.
Você pode encontrar o local de divisão de interesse com uma varredura inicial usando o sinal de autofluorescência ao longo do plano Z. Com isso, use os parâmetros do seu marcador de proteína fluorescente para visualizar o sinal da sua proteína de interesse no local de divisão. Agora você pode realizar experimentos de lapso de tempo de acordo com o modelo biológico e a proteína de interesse.
Neste caso, podemos ver toda a estrutura do anel Z no mutante FtsZ-GFP, no plano XY. Com nosso método, conseguimos registrar a dinâmica desses anéis em um longo período de tempo. Finalmente, com as mudanças na intensidade da fluorescência, concluímos que esta estrutura é altamente dinâmica em nosso modelo.
Este método é um protocolo rápido e de baixo custo para registrar a dinâmica de proteínas no sítio de divisão por meio de microscopia confocal aplicada a morfologias complexas como cianobactérias filamentosas, usando Anabaena como modelo.
