בחיידקים, חקר הדינמיקה של חלבוני חלוקת התא דורש אוריינטציה מרחבית של התאים. לדוגמה, במקרה של טבעת Z, המרכיב העיקרי בחלוקת התא החיידקי, כיוון אנכי הוא בסיסי כדי להקליט את כל המבנה במישור XY. בסרטון זה, אנו מפתחים שיטה להשגת אוריינטציה מסוימת זו בציאנובקטריה נימית Anabaena.
Anabaena הוא אורגניזם פוטוסינתטי רב-תאי, וחולק עם חיידקים אחרים את היכולת להשתמש בדיניטרוגן אטמוספרי כמקור חנקן. בהיעדר אלמנט זה, Anabaena להבדיל תאים המתמחים קיבוע חנקן. לכן, הוא מספק מודל מצוין שבו לנתח את הקשר בין חלוקת התא לבין רב תאיות.
ראשית, בחר רכיב divisome נוכח זן ציאנובקטריאל נימה המטרה. לצורך הניסוי יש צורך לבנות מוטציה ציאנובקטריאלית נימית המבטאת את הרכיב הדיוויזום שנבחר המאוחה לחלבון פלואורסצנטי. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במוטציה Anabaena המבטאת FtsZ המאוחה ל- GFP כדוגמה.
ראשית, ליצור תת-תרבית חדשה של המוטנט עם 10 מיליליטר של תרבית בשלב נייח, ו-90 מיליליטר של תווך נוזלי. לאחר מכן לגדל את תרבית התאים החדשה באור קבוע ובטמפרטורה אופטימלית, עד שמגיעים לשלב המעריכי. בדוגמה שלנו, המוטציה גודלה ב-25 מעלות צלזיוס במשך שבעה ימים.
עכשיו לוקחים שני מיליליטר מתרבות הגידול ושמים אותם בצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 2, 500 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, בדוק שכל התאים נמצאים בתחתית הצינור.
היזהר בעת הטיפול בדגימות, כדי למנוע השעיה חוזרת. חממו את תמיסת האגרוז בעלת נקודת ההתכה הנמוכה ב-3% במיקרוגל. חשוב לעשות זאת בפרקי זמן קצרים, ולבדוק את התמיסה עד נוזלית לחלוטין.
ברגע שהוא נמס, מניחים בצד כדי להתקרר. קח את צינורות הצנטריפוגות של השלב הקודם, השליך 1.9 מיליליטר של supernatant, ו להשעות מחדש את התאים בנפח הנותר על ידי pipeting לפחות שלוש פעמים למעלה ולמטה. במקום העבודה שלך, שים את הצינור עם התאים, תמיסת האגרוז המומסת, מזרק של מיליליטר אחד חתוך בקצה, ואזמל עם להב חדש ונקי.
לאחר מכן מערבבים את התאים עם 900 מיקרוליטר של תמיסת 3% agarose על ידי pipetting לפחות שלוש פעמים. חשוב מאוד לוודא כי הפתרון agarose הוא לא חם מדי, אבל נשאר נוזלי. עם זאת, אנו נמנעים מנזק לתאים במהלך תהליך זה.
השלב הבא חייב להיעשות מהר, ולפני הפתרון agarose gelifies. למצוץ את מטריצת agarose מזרק אחד מיליליטר, בזהירות. חשוב להימנע מיצירת בועות בזמן שהדגימה נשאבת.
לאחר מכן, לדגור את המדגם, לשים את המזרק במצב אופקי בטמפרטורת החדר במשך שעתיים. לאחר הדגירה, בזהירות להסיר את המטריצה עם התאים באמצעות הבוכנה במשטח נקי ושטוח. באמצעות אזמל, לחתוך את מדגם ג'ל לפרוסות דקות ככל האפשר, שמירה על שלמות המטריצה.
לאחר מכן הפקידו את הדגימות בתלוש הכיסוי המתאים, זו לצד זו. כפי שמוצג בסרטון, בשלב זה, תוכל להשתמש בעצה כדי לסייע בתהליך הטיפול בדגימה. עבור ניסויים בהילוך מהיר, מומלץ להשתמש בתא תא המיועד לניתוח מיקרוסקופיה.
במקרה זה, אנו משתמשים בכיסויים עגולים המתאימים לתאים מסוג זה, כפי שניתן לראות בסרטון. לבסוף, כדי למנוע התייבשות של הדגימה, להוסיף נפח נוסף של תמיסת 3% agarose מומס בתוך החדר. לפני ההדמיה, המתן עד agarose הוא gelified לחלוטין.
עכשיו לשים את החדר עם התאים במיקרוסקופ להדמיה. מומלץ להשתמש בציוד עם בקרת טמפרטורה ולחות. דמיינו את הדגימה בשדה בהיר עם הגדלה מרבית, וחפשו חוט להט בכיוון אנכי.
ניתן למצוא את אתר החלוקה המעניין בסריקה ראשונית באמצעות האות האוטופלואורסצנטי לאורך מישור Z. עם זאת, השתמש בפרמטרים של סמן החלבון הפלואורסצנטי שלך כדי לדמיין את האות של החלבון שלך של עניין באתר החלוקה. כעת ניתן לבצע ניסויים בהילוך מהיר על פי המודל הביולוגי והחלבון המעניין.
במקרה זה, אנו יכולים לראות את כל המבנה של טבעת Z במוטציה FtsZ-GFP, במישור XY. בעזרת השיטה שלנו, היינו מסוגלים להקליט את הדינמיקה של הטבעות האלה בפרק זמן ארוך. לבסוף, עם השינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות, אנו מסיקים כי מבנה זה הוא דינמי מאוד במודל שלנו.
שיטה זו היא פרוטוקול מהיר וזול לרישום דינמיקת החלבונים באתר החלוקה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המיושם על מורפולוגיות מורכבות כציאנובקטריה נימה, תוך שימוש באנבאנה כמודל.
