In Bakterien erfordert die Untersuchung der Dynamik von Zellteilungsproteinen eine räumliche Orientierung der Zellen. Im Falle des Z-Rings, dem Hauptbestandteil der bakteriellen Zellteilung, ist beispielsweise eine vertikale Orientierung von grundlegender Bedeutung, um die gesamte Struktur in der XY-Ebene zu erfassen. In diesem Video entwickeln wir eine Methode, um diese spezielle Orientierung in den filamentösen Cyanobakterien Anabaena zu erreichen.
Anabaena ist ein mehrzelliger photosynthetischer Organismus und teilt mit anderen Bakterien die Fähigkeit, atmosphärischen Distickstoff als Stickstoffquelle zu nutzen. In Abwesenheit dieses Elements differenzieren Anabaena Zellen, die auf die Stickstofffixierung spezialisiert sind. Daher bietet es ein hervorragendes Modell, um die Beziehung zwischen Zellteilung und Vielzelligkeit zu analysieren.
Wählen Sie zunächst eine divosomale Komponente aus, die im filamentösen Cyanobakterienstamm vorhanden ist. Für das Experiment ist es notwendig, eine filamentöse cyanobakterielle Mutante zu konstruieren, die die ausgewählte divosomale Komponente exprimiert, die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert ist. In diesem Protokoll verwenden wir als Beispiel eine Anabaena-Mutante, die FtsZ exprimiert, die mit GFP fusioniert ist.
Stellen Sie zunächst eine frische Subkultur der Mutante mit 10 Millilitern einer Kultur in stationärer Phase und 90 Millilitern flüssigem Medium her. Dann züchtet die neue Zellkultur bei konstantem Licht und optimaler Temperatur, bis sie die exponentielle Phase erreicht. In unserem Beispiel wurde die Mutante sieben Tage lang bei 25 Grad Celsius gezüchtet.
Nehmen Sie nun zwei Milliliter der Wachstumskultur und geben Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 2.500 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie nach der Zentrifugation, ob sich alle Zellen auf dem Boden des Röhrchens befinden.
Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit den Proben, um eine erneute Suspension zu vermeiden. Erhitzen Sie die 3%ige Agaroselösung mit niedrigem Schmelzpunkt in der Mikrowelle. Es ist wichtig, dies in kurzen Zeitabständen zu tun und die Lösung zu überprüfen, bis sie vollständig flüssig ist.
Sobald es geschmolzen ist, zum Abkühlen beiseite stellen. Nehmen Sie die Zentrifugenröhrchen des vorherigen Schritts, verwerfen Sie 1,9 Milliliter des Überstandes und suspendieren Sie die Zellen im verbleibenden Volumen erneut, indem Sie mindestens dreimal auf und ab pipettieren. Legen Sie das Röhrchen mit den Zellen, der geschmolzenen Agaroselösung, einer Ein-Milliliter-Spritze, die in die Spitze geschnitten ist, und einem Skalpell mit einer neuen und sauberen Klinge an Ihren Arbeitsplatz.
Anschließend werden die Zellen mit 900 Mikrolitern der 3%igen Agaroselösung durch mindestens dreimaliges Pipettieren vermischt. Es ist wirklich wichtig darauf zu achten, dass die Agaroselösung nicht zu heiß ist, sondern flüssig bleibt. Damit vermeiden wir Zellschäden während dieses Prozesses.
Der nächste Schritt muss schnell und vor dem Gelieren der Agaroselösung erfolgen. Saugen Sie die Agarosematrix in einer Ein-Milliliter-Spritze vorsichtig auf. Es ist wichtig, die Bildung von Blasen während des Aufsaugens der Probe zu vermeiden.
Danach inkubieren Sie die Probe und bringen Sie die Spritze zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in horizontale Position. Entfernen Sie nach der Inkubation vorsichtig die Matrix mit den Zellen mit dem Kolben auf einer sauberen und ebenen Oberfläche. Schneiden Sie die Gelprobe mit dem Skalpell in möglichst dünne Scheiben, um die Integrität der Matrix zu erhalten.
Legen Sie dann die Proben nebeneinander in das entsprechende Deckglas ein. Wie im Video gezeigt, können Sie in diesem Schritt einen Tipp verwenden, um den Handhabungsprozess der Probe zu unterstützen. Für Zeitraffer-Experimente empfiehlt sich die Verwendung einer Zellkammer, die für die mikroskopische Analyse vorgesehen ist.
In diesem Fall verwenden wir kreisförmige Deckgläser, die in diese Art von Kammern passen, wie Sie im Video sehen können. Um eine Austrocknung der Probe zu verhindern, fügen Sie schließlich ein zusätzliches Volumen geschmolzener 3%iger Agaroselösung in die Kammer hinzu. Warten Sie vor der Bildgebung, bis die Agarose vollständig geliert ist.
Legen Sie nun die Kammer mit den Zellen für die Bildgebung in das Mikroskop. Es wird empfohlen, ein Gerät mit Temperatur- und Feuchtigkeitsregelung zu verwenden. Visualisieren Sie die Probe im Hellfeld mit maximaler Vergrößerung und suchen Sie nach einem vertikal ausgerichteten Filament.
Sie können die gewünschte Teilungsstelle mit einer ersten Abtastung unter Verwendung des Autofluoreszenzsignals entlang der Z-Ebene finden. Verwenden Sie dazu die Parameter Ihres fluoreszierenden Proteinmarkers, um das Signal Ihres interessierenden Proteins an der Teilungsstelle zu visualisieren. Jetzt können Sie Zeitraffer-Experimente entsprechend dem biologischen Modell und dem interessierenden Protein durchführen.
In diesem Fall können wir die gesamte Struktur des Z-Rings in der FtsZ-GFP-Mutante in der XY-Ebene sehen. Mit unserer Methode waren wir in der Lage, die Dynamik dieser Ringe über einen langen Zeitraum aufzuzeichnen. Mit den Änderungen der Fluoreszenzintensität schließen wir schließlich, dass diese Struktur in unserem Modell sehr dynamisch ist.
Diese Methode ist ein schnelles und kostengünstiges Protokoll, um die Proteindynamik an der Teilungsstelle mittels konfokaler Mikroskopie zu registrieren, die auf komplexe Morphologien als filamentöse Cyanobakterien angewendet wird, wobei Anabaena als Modell verwendet wird.
